Implementation

Comentarios sobre el sistema de expresión

La determinación del fenotipo bioquímico de una mutación en un sistema de sobrexpresión y usando un sustrato artificial no refleja necesa- riamente los eventos moleculares reales dentro del lisosoma pero puede ser usado como guía para predecir el fenotipo.

Las células COS-7 se consideraron un sistema más cercano al humano que los utilizados por otros autores, basados en células de roedor. Además, los valores de actividad de la proteína endógena podían ser sustraídos de los valores de actividad obtenidos tras la sobreexpresión. Los ensayos enzimáticos realizados tras diferentes períodos post-transfección indicaban que pese a la sobreexpresión artificial de la proteína no parecía producirse saturación del sistema celular y se eligieron las 48 horas como tiempo suficiente en el que la proteína sintetizada podía ser procesada correctamente.

Tampoco se consideró necesario recurrir a la creación de líneas de expresión estables, porque el uso prolongado de antibióticos de selección y el mantenimiento de los pases podría llegar a ser más artefactual incluso que la expresión transitoria de una gran cantidad de proteína.

De todos modos, hay que tener en cuenta que el procesamiento hacia la forma madura de la ARSB depende de la enzima que cataliza la modificación post- traduccional del residuo cisteína 91 (SUMF1). De hecho en los últimos

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experimentos de terapia génica en gatos con MPS VI, con administración intra- muscular de vectores víricos que expresan ARSB, se expresó de forma análoga SUMF1 para prevenir la saturación de la enzima (Anson et al., 1993; Comsa et al., 2003; Haskins et al., 2005), a pesar de que había indicios de que tal saturación no era probable que se produjera, al menos en células hepáticas (Haskins et al., 2004). Si SUMF1 es rápidamente saturada con la sobrex- presión de una sulfatasa in vivo o in vitro, podría haber limitaciones en la cantidad de enzima que se puede producir y una reducción de la actividad de otras sulfatasas que requieren la misma modificación. Esto sólo es importante cuando se parte de un número muy elevado de copias del gen (Hanskins et al., 2004). El receptor manosa-6-fosfato, situado en la membrana del Golgi, es otro paso del sistema que se podría saturar. En el caso de nuestros estudios de expresión al menos un 50% del total de proteína salvaje es procesada a su forma madura, y en el caso de los alelos mutados no parece haber indicios de saturación. La medida de otra sulfatasa lisosómica que requiera el mismo proceso mediado por SUMF1 hubiera permitido saber si se estaba produciendo una saturación del sistema.

Posibles efectos de las mutaciones en el plegamiento correcto y la degradación

de la proteína

Todas las mutaciones de cambio de sentido expresadas en este trabajo dan lugar a una actividad enzimática muy disminuída. Esto puede deberse a que estén afectando sitios funcionales de la proteína o a que disminuyan los niveles de proteína que llegan al lisosoma desde su lugar de síntesis (debido a la degradación prematura, al mal plegamiento y/o a la alta tasa de recambio de la conformación plegada).

Sólo el cambio p.Y138C parece estar afectando un residuo importante a nivel catalítico. Las mutaciones que afectan directamente sitios funcionales no suelen ser las más frecuentes entre las enfermedades genéticas clínicamente reconocibles (Bross et al., 1999). Las mutaciones que afectan residuos cisteína y prolina (p.P313A, p.L472P, p.C447F y p.Y138C) implican además cambios conformacionales en la estructura de la proteína que quizá tengan un efecto funcional.

Es difícil predecir o estimar el efecto de una mutación dada sobre el plegamiento de un polipéptido y su tendencia a la degradación. Aunque la predicción biocomputacional puede resultar útil, en última instancia siempre es necesario recurrir a experimentos empíricos de expresión. En relación con las estimaciones computacionales, sin la ayuda de modelizaciones 3-D in silico basadas en estructuras cristalográficas reales, los programas de predicción de estructuras secundaria de uso común dan resultados poco fiables. Sin embargo, durante la realización de esta tesis se usaron algunos de estos programas, como NNPredict y Protein Structure Prediction Server (PSIPRED v.2.5, que es el más utilizado en la bibliografía), cuyos resultados deben interpretarse con precaución.

En relación con los estudios de expresión, existe el problema de la comparación de los resultados obtenidos mediante sistemas de expresión y laboratorios diferentes. Los niveles relativos de proteína mutante o funcional acumulada pueden variar enormemente en función del sistema celular usado, el método de transfección, las condiciones físico-químicas concretas de cada experimento y otros parámetros. Todos los estudios de expresión publicados hasta la fecha (ver página 48), si bien realizados en sistemas de expresión diferentes, apuntan a que la retención y

degradación de la ARSB plegada incorrectamente en el RE podría explicar los bajos niveles de proteína observados en los pacientes y en los ensayos de sobrexpresión.

Los estudios de Arlt et al. (1994), Isbrandt et al. (1994), Brooks et al. (1995), Bradford et al. (1999) y Karageorgos et al. (2004) demostraron para distintas mu- taciones de cambio de aminoácido que la forma precursora es retenida en RE y se degrada antes de llegar a la red trans- Golgi, y mucho menos al sistema endosoma/lisosomas. No se detectó procesamiento de la ARSB hacia la forma madura y las formas mutantes tampoco eran secretadas al medio extracelular.

Nuestros resultados de western blot e inmunolocalización apuntan también a un defecto de procesamiento hacia proteína madura y a una disminución de la cantidad total de proteína ARSB en la célula, más que a una ubicación incorrecta de la enzima.

Bradford et al. (2002) también demostraron que la baja actividad ARSB debida a la mutación p.Y210C podía explicarse por algún problema de estabilidad, pues al tratar células portadoras de la mutación con el estabilizador glicerol aumentó la concentración de la proteína en los endosomas.

Es posible que la proteína retenida en el RE interactue con chaperonas como BiP, pero esto no es necesariamente sinto- mático de degradación porque BiP parece interactuar tanto con la forma salvaje como con la mutada de la proteína (Brooks et al., 1995). Los ensayos cinéticos de la proteína residual indican que en la mayoría de casos, si hubiera niveles normales de proteína, habría suficiente actividad catalítica para revertir las manifestaciones clínicas (Brooks et al., 1991 y 1993).

8. Estudios sobre la degradación de