Implementation Challenges

Uno de los aspectos importantes en toxicología y ecotoxicología es la relación entre la concentración de un compuesto químico a la cual se expone un organismo y el consecuente efecto nocivo que le produce. Esta relación, conocida como la relación dosis-respuesta, constituye la base para la evaluación del peligro y el riesgo generado por las sustancias químicas en el medio ambiente. Los gráficos bivariables de estas relaciones muestran en general patrones no rectilíneos de tipo sigmoide.

Figura 2. Gráfico de la relación dosis – respuesta.

Existen muchas formas de determinar la toxicidad, y aunque los efectos bioquímicos, fisiológicos, reproductivos y de comportamiento son de gran utilidad, el indicador comúnmente más utilizado es la muerte del organismo de prueba. La mayoría de las pruebas de toxicidad suministran una estimación de la dosis (o concentración en el alimento, aire o agua) que produce una respuesta tóxica a un nivel del 50%. Como es el ejemplo de la dosis letal media definida como la concentración que mata al 50% de la población (CL50).

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Para poder dar cumplimiento a los requerimientos de validez y precisión de las pruebas es necesario utilizar una metodología estadística desde la planificación hasta la ejecución y, luego, el posterior análisis de los resultados. El criterio básico recomendado es seleccionar un método estadístico sencillo, que se ajuste a las condiciones experimentales y que permita obtener resultados válidos.

El principio básico en el diseño estadístico es la aleatorización, por ello los esfuerzos y el tiempo dedicados a cumplir con este principio producirán resultados más confiables y reproducibles, ya que el concepto de muestra aleatoria es un requisito indispensable para la validez de cualquier prueba estadística.

En las pruebas de toxicidad en general se utilizan dos diseños básicos:

1. Establecimiento de una relación dosis-respuesta: Como resultado del análisis de los datos de un diseño para estimar una relación dosis-respuesta, lo que se pretende obtener son las estimaciones de los parámetros del modelo seleccionado para relacionar las variables y, a continuación, utilizar el modelo con las estimaciones de los parámetros encontrados para determinar los valores de la variable concentración de tóxico que causan un grado de efecto, en particular sobre los organismos expuestos. Entre estas concentraciones, la más utilizada es la que se conoce como concentración letal, efectiva o inhibitoria 50 (CL50/CE50/CL50), que es la concentración que produce la respuesta esperada sobre el 50% de los organismos expuestos.

- Establecimiento de una relación dosis-respuesta de tipo mortalidad: La selección del método a utilizar para estimar los valores de CL50/CE50/CL50 de este tipo de pruebas de toxicidad aguda con múltiples concentraciones dependerá de la forma de la distribución de tolerancias, y que tan bien las concentraciones o dosis seleccionadas la caracterizan (por ejemplo, el número de mortalidades parciales).

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En general, se recomiendan los siguientes cuatro métodos para la estimación de CL50/CE50/CL50: método Probit (paramétrico), método de Litchfield-Wilcoxon (gráfico), método de Sperman-Karber (no paramétrico) y método gráfico.

En la siguiente figura se presenta el diagrama de flujo recomendado por la USEPA (1993) para la selección del método, basado en los requerimientos de cada uno.

Figura 3. Selección del método para la estimación de la CL50

No No ^No No Datos de mortalidad. núm. de muertos Dos o más mortalidades

¿Es el modelo apropiado? (Ensayo del X² significativo)

Método Probit ¿Una o más mortalidades parciales? ¿Mortalidad cero en la concentración más baja y mortalidad 100% en la concentración más alta? Método de Sperman-Karber CL50 e intervalo de confianza al 95% Método de Sperman-Karber ajustado Método gráfico CL50 Sí Sí Sí Sí

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Análisis de regresión y análisis Probit. El procedimiento Probit permite encontrar

estimadores m-verosímiles de parámetros de regresión y de tasas naturales (por ejemplo, tasas de mortalidad) de respuesta para ensayos biológicos cuantales, analizando porcentajes de efecto vs. Dosis dentro del marco de la regresión.

Consiste básicamente en la aplicación de correlaciones estadísticas para estimar las consecuencias desfavorables sobre una población a los fenómenos físico peligroso; da una relación entre la función de probabilidad y una determinada carga de exposición.

Método de Litchfield-Wilcoxon. Este método consiste en la construcción de una

gráfica a partir de los datos obtenidos en pruebas de toxicidad aguda de un agente tóxico. Se utiliza papel prob-log, en el cual se colocan en el eje de las X el logaritmo (X) de las concentraciones usadas y en el eje de las Y el porcentaje de respuesta del efecto observado. Para el cálculo de la CL50/CE50/CL50 mediante este método, es necesario tener por lo menos, un porcentaje intermedio de efecto observado (valores entre 0 y 100% de efecto).

Método de Spearman-Kärber. El método de Spearman-Kärber es un método

aproximado, no paramétrico, que proporciona una buena estimación de la media y la desviación estándar. Si la distribución es simétrica, se obtiene una estimación de la concentración total mediana (CL50/CE50/CL50).

Método gráfico. Además de los métodos anteriores, se puede utilizar el método

gráfico para estimar la CL50/CE50/CL50. De forma similar, se parte de los datos obtenidos en las pruebas de toxicidad aguda, y utilizando papel logarítmico se grafican en el eje de las X las concentraciones (mg/L) y en el eje de las Y el porcentaje de mortalidad. Se colocan los puntos de los porcentajes de mortalidad observados (en escala lineal) en función de las concentraciones probadas (en escala logarítmica); se conectan los puntos obtenidos más cercanos al 50% del

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efecto observado, o sea, a la mayor concentración que no causa efecto tóxico y a la menor concentración que causa efecto tóxico. A partir de la recta trazada, se obtiene el punto de corte correspondiente al 50% del efecto observado. Este valor corresponde al CL50/CE50/CL50del estímulo o agente estudiado. Cuando no se logra hacer un ajuste adecuado de los datos, se pueden utilizar otros métodos para hacer las estimaciones de CL50/CE50/CL50.

2. Pruebas para evaluar la diferencia entre organismos expuestos a distintas dosis contra un control negativo (dosis 0).

Este tipo de análisis se realiza para determinar la concentración más alta a la que no se observa efecto (NOEC) o la concentración más baja a la que se observa efecto (LOEC) e implica pruebas de hipótesis. El método clásico para este tipo de análisis es el ANOVA, el cual sirve para comparar si los valores de un conjunto de datos numéricos son significativamente distintos a los valores de otro o más conjuntos de datos. El procedimiento para comparar estos valores está basado en la varianza global observada en los grupos de datos numéricos a comparar. Típicamente, el análisis de varianza se utiliza para asociar una probabilidad a la conclusión de que la media de un grupo de puntuaciones es distinta de la media de otro grupo de puntuaciones. (Castillo, 2004, pp. 99-110)