6.1. Caracterización e identificación de los segmentos del túbulo
proximal en el riñón
El tejido cortical renal contiene numerosas estructuras tubulares. En los estudios inmunohistoquímicos realizados en riñón se establece un criterio para la caracterización e identificación de los diferentes segmentos del túbulo proximal, debido a que las proteínas evaluadas presentan alta expresión en esta porción de la nefrona. En primer lugar, se tuvo en cuenta que los túbulos proximales son muy abundantes en la corteza renal y que poseen epitelio cúbico con un lumen angosto.
Luego de la identificación de los túbulos proximales, los diferentes segmentos de estos túbulos se caracterizan e identifican empleando un criterio de clasificación que se basa en la localización diferencial y en las características estructurales específicas que posee cada segmento (Wolff et al., 2011):
- Los segmentos S1 y S2 se encuentran principalmente en la corteza, cercanos a los glomérulos;
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- Los segmentos S3 se encuentran en el límite de la corteza, muy cercanos a la región externa de la médula externa;
- El lumen de los segmentos S1 y S3 es más angosto que el de los segmentos S2.
7. ANTICUERPOS
7.1. Anticuerpos primarios
Anticuerpo Características Dilución IHQ Dilución WB Tiempo de incubación Proveedor DMT1 Conejo anti- ratón 1/250 1/500 1 hora T ambiente
Cedido por Canonne Hergaux (Canonne- Hergaux et al., 1999) FPN Conejo anti- ratón 1/200 1/1000 Overnigth 4°C
Cedido por Knutson (Knutson et al., 2005)
ZIP14 Conejo anti- ratón
10µg/ml 4µg/ml Overnigth 4°C
Cedido por Cousins J (Liuzzi et al., 2005) RTf1 Conejo anti- ratón 1/100 1/200 Overnigth 4°C Santa Cruz Biotechnology
HFE Conejo anti- ratón
1/100 1/3000 Overnigth 4°C
Cedido por Fleming R (Parkkila et al., 1997)
Prohepcidina Conejo anti- humano
1/500 Overnigth
4°C
Cedido por Ganz T (Valore & Ganz, 2008)
Ferritina Conejo anti- ratón 1/500 Overnigth 4°C Cedido por Santambrogio P (Santambrogio et al., 2000)
Actina Cabra anti- ratón
1/5000 1 hora T ambiente
Santa Cruz Biotechnology
GAPDH Conejo anti- ratón
1/1000 1 hora T ambiente
Cell Signaling Technology
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7.2. Anticuerpos secundarios
8. INMUNOHISTOQUÍMICA
8.1. Fundamento
Los métodos inmunohistoquímicos utilizan como principio la especificidad de las reacciones antígeno-anticuerpo, que se ponen en evidencia empleando diferentes métodos (Boenisch, 2002). Para visualizar el sitio de unión antígeno-anticuerpo es preciso emplear un trazador. Las técnicas inmunohistoquímicas utilizadas en nuestras experiencias, son técnicas de inmunolocalización que utilizan una enzima como trazador del marcaje. Por este motivo, el lugar de la reacción antígeno-anticuerpo se visualiza añadiendo el sustrato de la enzima junto con un cromógeno. El producto originado, por acción de la enzima sobre el sustrato, interacciona con el cromógeno y da lugar a un compuesto coloreado. En nuestro caso utilizamos la enzima peroxidasa como trazador. Las técnicas de inmunoperoxidasa tienen en común la utilización de la enzima peroxidasa acoplada a un anticuerpo, ya sea el primario o el secundario (Boenisch, 2002).
En nuestros estudios utilizamos el método directo de detección, que se basa en la unión de un anticuerpo primario con el antígeno de interés en el tejido y la posterior detección, utilizando un anticuerpo secundario marcado con enzima peroxidasa dirigido contra el anticuerpo primario. La localización del antígeno de interés se revela mediante el agregado de la solución sustrato de la enzima y de su cromógeno.
Anticuerpo Dilución IHQ Dilución
WB
Tiempo de incubación Proveedor
Anti-ratón, conjugado con HRP 1/100 1/2000 1 hora T ambiente Alpha Diagnostic Anti-cabra, conjugado con HRP - 1/5000 1 hora T ambiente Santa Cruz Biotechnology
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8.2. Procedimiento experimental
8.2.1. Procesamiento de tejidos
8.2.1.1. Fijación: Para la fijación de tejidos fue utilizado formol buffereado debido a su
rápida penetración, bajo costo, fácil preparación y por la adecuada conservación de estructuras tisulares e intracitoplasmáticas. El formaldehído reacciona principalmente con aminoácidos básicos para formar uniones cruzadas de puentes de metileno. En esta fijación se rompen los enlaces débiles, se forman enlaces covalentes y se remueven átomos de hidrógeno que son reemplazados por el mismo fijador. El fijador contiene formalina (formaldehido al 37-40% p/v) y un sistema buffer que permite mantener el pH de la solución. Esta solución es estable durante muchos meses a temperatura ambiente. Pequeños bloques de tejido, de 10x10x3mm aproximadamente, fueron fijados durante 24 horas para inmunohistoquímica y se utilizaron 15 a 20 volúmenes de fijador por cada volumen del bloque tisular. Para preparar 1 litro de formol-buffer 10% se utilizó: fosfato sódico monobásico (4 g/L), fosfato sódico dibásico (6,5 g/L) y formol (100 mL/L).
8.2.1.2. Inclusión y cortes del material en micrótomo: Luego de la fijación del material en
formol buffereado, se procede a la inclusión en un material para poder realizar cortes histológicos. El fijador es acuoso e impide la penetración de la parafina. Por ello, es necesario realizar una deshidratación del tejido para poder incluirlo en parafina. Esto se realiza sumergiendo las piezas en líquidos anhidros de graduación creciente (50°, 96°, 100°) y, luego, se sumergen en tolueno durante 1 hora. Por último los tejidos son incluidos en parafina durante 2 horas y posteriormente se realiza el entacado del material tisular en cassettes histológicos. Utilizando un micrótomo tipo Minot (Leica) se realizaron cortes de 5 μm de espesor.
8.2.2. Inmunodetección
El procedimiento experimental consiste en desparafinar con xilol los cortes de tejidos incluidos en parafina e hidratarlos utilizando alcoholes en graduación decreciente (100°, 96°, 70˚, 50°) hasta llegar al lavado con buffer PBS, pH: 7.0-7.2 (en g/L: NaCl 7; KCl 0,2; KH2PO4 0,43; Na2HPO4 1,48).
En todos los casos, debido a que algunos tejidos contienen peroxidasa endógena, es necesario realizar un pre-tratamiento con solución saturada de peróxido de hidrógeno que
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inactiva a la peroxidasa endógena en forma irreversible, evitando la aparición de falsos positivos. Luego del bloqueo de la peroxidasa endógena con H2O2 al 3 %, se realiza un
lavado con buffer PBS. Para ZIP14, se realiza recuperación de epitopes con buffer citrato de sodio pH 6.0- 0,05% Tween 20 a 95-100°C durante 10-20 minutos. Posteriormente, los cortes se bloquean con BSA 1% (albúmina sérica bovina) y se incuba con el anticuerpo primario. Este tiempo de incubación depende del anticuerpo utilizado. Luego de lavar con buffer PBS, los cortes se incuban con el anticuerpo secundario correspondiente.
El revelado se realiza observando al microscopio y agregando 50 μL del revelador preparado en buffer que contiene el sustrato H2O2 y el cromógeno DAB
(3,3´diaminobenzidina), preparado siguiendo las instrucciones del kit (Cell Marque). Se mantiene en contacto con el revelador hasta que la intensidad de color sea la adecuada; este tiempo de revelado depende tanto del anticuerpo utilizado como del tejido (Tabla 3). Por último, los cortes son contrastados con hematoxilina y deshidratados mediante una batería de alcoholes de graduación creciente (50˚, 96°, 100°) hasta llegar al xilol. Por último, los cortes son montados empleando bálsamo de Canadá.
Para el procesamiento de los controles negativos se reemplaza en anticuerpo primario por buffer PBS. En nuestras experiencias, la inmunomarcación fue analizada utilizando un microscopio BX51 (Olympus, Tokio, Japón) equipado con objetivos secos (x10, x20, x40) y un objetivo de inmersión en aceite (x100). Las imágenes se adquirieron utilizando una cámara Olympus C7070 acoplada al microscopio óptico.
DMT1 ZIP14 RTf1 Ferritina Prohepcidina HFE FPN
Duodeno 45´´
Hígado 1´ 30´´ 2´ 2´
Pulmón 2´ 3´ 2´ 30´´ 3´ 4´ 3´
Páncreas 3´ 2´ 3´
Riñón 2´ 2´ 30´´ 3´ 1´ 30´´ 2´
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