A todos los grupos se les harán los estudios, que se indican a continuación:
Al grupo de animales que se sacrifique, de acuerdo al calendario de sacrificios y análisis, se les practicarán los siguientes estudios
Microscopia electrónica de barrido ambiental (SEM) Biomecánico
Histológico Fotoacústico
4.3.2.1 Estudios de microscopia electrónicade barrido ambiental. Objetivos:
Conocer los porcentajes de:
- Calcio
- Cloro
- Fierro
- Fósforo
- Potasio - Silicio
- Sodio
Obtener microfotografías que permitan conocer el avance de la formación del callo, así como sus dimensiones, en diferentes etapas.
Principal equipo de este estudio: Microscopio: marca Phillips Modelo: XL-30-ESEM
Procedimiento para el estudio de microscopia electrónica de barrido ambiental. - Fijar las tibias en glutaraldeido al 2.5 % durante una hora.
- Lavar cada muestra 4 veces durante 5 minutos con amortiguador de fosfatos (0.1, pH = 7.4). - Posteriormente, lavar con agua desionizada, para eliminar residuos del fijador.
- Retirar todo el tejido blando de la tibia.
- Hacer cortes longitudinales de la zona de la fractura. Las dimensiones son aproximadamente de 5 x 5 cm
- El fragmento se coloca en un porta muestras circular de acero inoxidable y se fija con plastilina conductiva, de alto contenido de carbono (marca NEUBAUER CHEMIKALIEN) - Colocación del porta muestras en la cámara del ESEM-EDX, en condiciones de vació (0.9
Torr)
- Observar directamente al microscopío.
Número total de ratas disponible para este estudio: 5 por cada grupo de estudio
4.3.2.2 Estudios biomecánicos.
Objetivo:
Hacer un estudio comparativo a flexión en tres puntos, de las tibias del grupo control con respecto a las del grupo experimental, como se muestra en la figura 5.5, para determinar:
- energía de deformación - resistencia a la cedencia - rigidez
De esta forma se espera determinar desde un punto de vista totalmente mecánico, cual es el avance del proceso de la consolidación, en función del tiempo.
Número total de ratas disponible para este estudio: 5 por cada grupo de estudio. Principal equipo de este estudio:
Máquina universal Instron. Modelo: 4502
Procedimiento:
- Desarticular ambas tibias, de una rata, de cada grupo y limpiarlas quitando todo tejido blando. - Identificar si son izquierdas ó derechas y al grupo que pertenecen.
- Programar la máquina universal Instron para hacer ensayos a flexión
Figura 4.5 Forma de hacer los estudios biomecánicos en las tibias fracturadas.
4.3.2.3 Estudio histológico.
Objetivos:
Analizar y cuantificar:
- el grosor del callo óseo
- la formación de vasos sanguíneos - la formación osteoíde
- la restauración ósea completa
- presencia de tejido conectivo, que puede ser:
laxo ó denso - presencia de osteoblastos
- tejido de granulación Procedimiento:
-
limpiar las tibias, dejándolas sin tejido blando.
- colocar, en frascos con formol, con una etiqueta indicando claramente el grupo al que pertenecen, así como la extremidad si es izquierda o derecha. Fecha de colocación del alambre Kirschner y de sacrificio. También el nombre del investigador responsable. Las muestras de tejido óseo se preparan según los siguientes pasos:
- Fijar el tejido en formol al 10 % - Deshidratar
- Colocar en baños de parafina
- Hacer inclusión de parafina del tejido - Hacer cortes a 5 µm
- Teñir con hematoxilina-eosina
- Hacer el montaje del tejido en cubreobjetos - Observar al microscopio
Temperaturas, y tiempos de exposición, son definidos, según el tamaño, y tipo de tejido a tratar, así como la densidad de la tinción a usar.
Número total de ratas disponible para este estudio: 5 por cada grupo de estudio.
4.3.2.4 Estudio fotoacústico.
Objetivos:
Determinar el espectro de absorción óptica, en los distintos estadios de la consolidación ósea de tibias fracturadas de ratas.
Número total de ratas disponible para este estudio: 5 por cada grupo de estudio. Procedimiento:
- Retirar completamente todos los tejidos blandos. - Lavar con agua.
- Envolverlas en papel, y dejarlas secar en forma natural, al menos un par de horas. Observar la zona donde se localiza el trazo de fractura. Si es muy pequeño raspar el callo formado y depositarlo en una bolsita de celofán o plástico(dimensiones de 10 x 6cm). En caso contrario, cortar un fragmento aproximado de 5x 4 mm y depositarlo en la bolsita.
- Colocar etiquetas de identificación.
Llevar las muestras al laboratorio de Foto acústica del departamento de Física del CINVESTAV.
En el laboratorio de Foto acústica el procedimiento es el siguiente: - Encender los siguientes equipos en el orden siguiente:
ventilador de la lámpara del monocromador ORIEL control del monocromador.
computadora personal.
chopper (SR-540 STANFORFD RESEARCH SYSTEMS)
Lámpara de xenón a través de un pulsado. - Colocar la muestra en la celda óptica.
- Se corre el programa de adquisición de datos (Bismex). Al establecerse este programa se indican los siguientes parámetros:
- longitud de onda inicial.
- 400 nm (que es el pico de emisión de la lámpara de xenón). Esto determina la señal máxima.
- Se selecciona la escala del amplificador lockin, de tal forma que la señal del
micrófono pueda ser modulada y amplificada. Se determina la más cercana al valor indicado, por la medición anterior, pero sin llegar a los extremos de la escala. - Una vez ajustada la escala, a través del programa se indican los siguientes
parámetros:
nombre del archivo. nombre del operador
- Intervalo de longitudes de onda que ha de proporcionar el monocromador.
Si el espectro que se desea obtener se quiere normalizado, con respecto al de la lámpara xenón, o no.
- Se da inicio para ejecutar el programa y todos los eventos relacionados al mismo. - Se captura la información para su análisis al final del estudio.
El análisis estadístico de todos los estudios se llevara a cabo con el programa SPSS.