mejoramiento genético y biología de la palma de
aceite y microorganismos asociados
Objetivo
Desarrollar herramientas de biología molecular, genómica funcional y proteómica en palma de aceite para el apoyo y avance de la investigación en sanidad, genética, mejoramiento, bio- logía de la palma de aceite y microorganismos asociados.
Actividades desarrolladas en 2015
Validación de una metodología para la detección de Ganoderma sp. en palmas afectadas con la Pudrición basal de estípite (PBE)
La detección molecular de patógenos en los cultivos es una herramienta vital para el diagnós- tico y manejo de las enfermedades. Una vez se estandariza su implementación, se gana en tiempo de diagnóstico, efectividad y especificidad. Las metodologías basadas en la técnica de amplificación del ADN mediante la reacción en cadena de la polimersa (PCR) han mostrado alta sensibilidad, reproducibilidad, precisión y rápidos resultados en comparación a los méto- dos microbiológicos convencionales.
La Pudrición basal de estípite (PBE) es la principal enfermedad que afecta los cultivos de pal- ma de aceite en el Sudeste Asiático. En Colombia se han reportado casos en diferentes zonas palmeras. El agente causal de esta enfermedad es Ganoderma boninese, sin embargo, otras especies del género Ganoderma se han asociado a este problema fitosanitario. El género de
Ganoderma es susceptible a ser detectado mediante detección molecular.
En 2015 se visitaron las plantaciones de las zonas Norte y Central para el muestreo en palmas que presentaban síntomas de PBE y al menos una palma asintomática (tejido control). Se co- lectaron tejidos de estípite (zona necrótica, externa y avance) y raíces, muestras de las que se extrajo el ADN que fue cuantificado para validar la metodología de detección de Ganoderma spp. por PCR cuantitativo en tiempo real.
Determinar, por métodos histológicos y bioquímicos, el punto exacto de inducción de genes de respuesta temprana y tardía a P. palmivora
La determinación de los factores genéticos que son claves en la respuesta de resistencia/ susceptibilidad al ataque de P. palmivora, permitirá un proceso de identificación temprana de materiales resistentes. Estos serán probados en campo y se facilitará su posterior inclusión en un programa de mejoramiento.
Utilizando los protocolos ya establecidos se inocularon con aislamientos de P. palmivora pro- venientes de las zonas Suroccidental y Central, seis líneas clonales de E. guineensis (codifica- das como ortet 1, 33, 57, 28, 35 y 34). A continuación se realizó la observación microscópica e identificación de estructuras del patógeno en el tejido foliar a las 2, 4, 6, 12, 24 y 48 horas post inoculación (Figura 5).
2 horas 4 horas 6 horas
12 horas 24 horas 48 horas
Figura 5. Estructuras del patógeno encontradas en diferentes tiempos de inoculación en diferentes ortets Flecha amarilla: zoosporas enquistadas una vez han perdido sus flagelos. Flecha roja: formación del apresorio. Flecha verde: apresorios. Flecha magenta: hifas aumentadas (hinchadas).
El análisis de medias de incidencia de síntomas en clones in vitro, mostró que el ortet 57 exhibió mayor susceptibilidad y el ortet 34 mayor resistencia. La naturaleza aparentemen- te susceptible del ortet 57 y resistente del ortet 34, fue corroborada mediante las pruebas bioquímicas de CAT (catalasa), POD (peroxidasa) y PAL (fenilamonioliasa) realizadas en seis tiempos postinoculación (12, 24, 48, 72, 96 y 120 horas).
Desarrollar una metodología para la extracción de RNA de clones inoculados con P. palmivora in vitro para obtener un listado de genes diferencialmente expresados en los clones inoculados
Los dos clones de comportamiento contrastante (ortet 57 y 34) se utilizaron en inoculaciones controladas y muestreo de tejido durante tres tiempos de infección (24, 72 y 120 horas pos- tinoculación), para tener un registro de los genes que se expresan diferencialmente durante la evolución de la interacción palma de aceite y P. palmivora.
El protocolo de extracción de RNA de clones in vitro inoculados artificialmente con P. pal-
mivora se logró con el producto CAT No. AM1912, que permitió obtener RNA de la calidad
necesaria para soportar el proceso de construcción de librerías de RNA mensajero (mRNA) y posterior proceso de secuenciación. Además, se incluyeron dos muestras control a las 72 horas postinoculación y una muestra del RNA del patógeno. Ya se cuenta con los datos crudos de la secuenciación del transcriptoma y se inició el análisis bioinformático con el paquete bio- conductor, especial para el análisis de datos en genómica pues permite obtener el catálogo preliminar de genes.
Estandarización de una metodología para la transformación de P. palmivora usando genes reporteros
Una aproximación muy utilizada para caracterizar las fases iniciales de las enfermedades cau- sadas por oomycetes como P. palmivora es a través de microscopía de fluorescencia. En esta se requiere el uso de genes reporteros que codifican proteínas fluorescentes, que con luz de longitudes de onda específicas emiten una longitud de menor energía.
Obtener aislamientos fluorescentes de P. palmivora es fundamental para poder realizar se- guimiento histológico, mediante microscopía de fluorescencia, del proceso de infección y co- lonización en tejido de palma de aceite. Esto permite mejorar las metodologías para evaluar el nivel de resistencia/susceptibilidad de diferentes materiales de palma de aceite y a su vez conocer los mecanismos moleculares de la interacción entre el patógeno y su hospedero. Los transformantes de P. palmivora se obtuvieron a través de transformación mediada por la bacteria Agrobacterium tumefaciens en tres aislamientos de P. palmivora provenientes de las zonas Suroccidental, Norte y Central. Las colonias transformadas de los aislamientos se evaluaron mediante técnicas de biología molecular y microscopía de fluorescencia que permiten determinar la correcta transformación. Una vez confirmadas molecularmente, se continuó con la evaluación histológica del proceso de infección, mediante la inoculación de tejido vegetal en condiciones controladas de laboratorio y seguimiento a las 3, 6 (Figura 6), 9, 12,18 (Figura 7) y 24 horas después del inóculo.
En el tejido observado a las seis horas posteriores a la inoculación se registran estructuras infectivas, tales como hinchamientos y estructuras similares a haustorios, que corresponden
Imagen sobrepuesta Imagen sobrepuesta sin contraste rojo
Filtro de luz ultravioleta Filtro verde fluorescente
Infection vesicle?
Figura 6. Observación de P. palmivora en discos foliares a las seis horas postinoculación en tejido inmaduro de hojas in vitro
Filtro verde fluorescente Filtro de luz ultravioleta Imagen sobrepuesta
Figura 7. Observación de P. palmivora en discos foliares a las 18 horas postinoculación en tejido inmaduro de hojas in vitro
claramente a las de un proceso infectivo compatible, evidenciando la virulencia del patógeno en el tejido de palma de aceite.
A medida que avanza el proceso de infección se advierte la colonización del tejido foliar tanto en tejido totalmente diferenciado como en tejido inmaduro. Sin embargo, es de resaltar que en el tejido inmaduro el proceso de infección avanza con mayor rapidez y la mayoría de los quistes lograron infectar el tejido. A las 18 horas, en el tejido foliar inmaduro se continúan observando estructuras similares a hinchamientos, crecimiento a través de los espacios inter- celulares y total colonización del tejido infectado.
A lo largo de todas las observaciones microscópicas realizadas, se evidenció la presencia de estructuras típicas de oomycetes durante el proceso de infección y se comprobó que P. pal-
mivora infecta con mayor facilidad los tejidos inmaduros o a través de heridas. Los resultados
de la diferenciada susceptibilidad de los tejidos servirán para desarrollar en el futuro una metodología que permita diferenciar tempranamente materiales de palma de aceite, por sus resistencia o susceptibilidad a P. palmivora.
Metodologías de genómica funcional para acelerar el mejoramiento genético de la palma de aceite
Para conocer la expresión diferencial de genes, a partir de la secuenciación del ARN (RN- ASeq), se está desarrollando un proceso en diferentes fases: i) procesamiento de los archivos FASTQ (secuencia de nucleótidos), ii) alineamiento al genoma de referencia y preparación de los valores de expresión de genes, iii) conteo de lecturas por fragmentos secuenciados, iv) análisis de la expresión diferencial de genes y vi) exploración visual de resultados con su respectiva clasificación de genes por clusters.
Los avances de Cenipalma provienen de un estudio de déficit hídrico en palma de aceite que busca encontrar los genes que se expresan bajo condiciones óptimas de riego y en condicio- nes de déficit hídrico.
Para esto, se evaluó la respuesta de dos materiales contrastantes mediante la reducción de la tasa de fotosíntesis al 30 y 70 %. Se seleccionaron 178 genes (p-value al 5 %) con altos va- lores en la media de cuenta de lecturas entre las muestras y sus correspondientes valores de expresión diferencial (FoldChange). Se categorizaron los genes que presentaron un compor- tamiento similar entre tratamientos, en siete grupos. La información obtenida será analizada con detalle según la función de los genes de cada grupo y como se expresan a través de los tratamientos.
En paralelo y como herramienta de soporte, el grupo de investigación que coordina el Oil Palm Genome Project (OPGP) en el CIRAD (investigación en la que participa Cenipalma), de- sarrolló la plataforma Genome Hub, que ofrece una serie de herramientas que permiten explorar/analizar los datos que generan las diferentes actividades de investigación de la ge- nómica funcional.