Otros de los procesos que mostraron gran cantidad de genes afectados en nuestro análisis fueron el transporte y metabolismo de poliaminas. En este caso, los genes gabT, gabD, gabP, potF, potH y gsp se encuentraron reprimidos en presencia de ácido linoleico y de manera dependiente de PhoP. Los tres primeros genes mencionados forman parte del operón gabDTPC, el cuarto y quinto gen también forman parte de otro operón, potFGHI, mientras que el último gen codifica para una
proteína bifuncional glutationilespermidina amidasa/glutationilespermidina
sintetasa, que cataliza la formación de glutationilespermidina a partir de glutatión y espermidina (así como también la reacción inversa).
Las poliaminas son pequeñas aminas catiónicas presentes en todas las células vivas. Las principales poliaminas en bacterias son putrescina y espermidina (289), y están involucradas en diversas funciones que incluyen señalización intracelular, resistencia a stress, resistencia a péptidos catiónicos, aminoglicósidos y quinolonas, y síntesis de ARN y proteínas (290–293). El contenido de poliaminas en las células está complejamente regulado por la biosíntesis, degradación, captación y excreción (294). Los precursores en la biosíntesis de putrescina son arginina (a través de agmatina) y ornitina, mientras que la degradación de la misma lleva a la generación de ácido γ-aminobutírico (GABA) y posteriormente a succinato (figura R&D.II.5).
El operón gabDTPC sintetiza las proteínas responsables del catabolismo de ácido γ-aminobutírico (figura R&D.II.5), uno de los intermediarios en la degradación de poliaminas. Cada gen del operón ha sido implicado en el catabolismo de GABA: GabD, una succinato semialdehído dehidrogenasa NADP específica que convierte succinato semialdehído en succinato; GabT, una transaminasa que desamina GABA a succinato semialdehído; y GabP, una permeasa para GABA (259, 295). Por su parte, GabC parece ser un repressor específico, ya que una deleción en gabC estimula el crecimiento con GABA como única fuente de nitrógeno (261). Tanto la limitación en nitrógeno como el ingreso en fase estacionaria de crecimiento activan la expresión del operón gab, mientras que en la primera de las condiciones se requiere de la proteína Nac, en el segundo caso es necesario el factor σS (260, 296, 297).
Por su parte, el operón potFGHI expresa un sistema de transporte ABC de captación de poliaminas. Hay dos sistemas de captación de poliaminas que funcionan a pH neutro, ambos pertenecientes a la familia de transportadores que unen ATP: uno, conformado por las proteínas PotA, PotB, PotC y PotD, que capta espermidina de modo preferencial; y otro, específico para captación de putrescina, que comprende las proteínas PotF, PotG, PotH y PotI (figura R&D.II.6). La primera, PotF, es la proteína periplásmica de unión a sustrato (putrescina); PotG es la proteína de unión a ATP; mientras que PotH y PotI son las proteínas integrales de membrana de este sistema de transporte de tipo ABC.
Otros dos transportadores de poliaminas, formados por una sola proteína, son PotE y CadB, que funcionan como anti-transportadores de putrescina/ornitina y cadaverina/lisina, respectivamente (294). Los genes potE y cadB constituyen un operón con genes para la ornitina descarboxilasa inducible (speF) o la lisina descarboxilasa inducible (cadA), respectivamente. Estas cuatro proteínas (PotE, CadB, SpeF y CadA) son importantes para el crecimiento celular a pH ácido porque pueden
FIGURA R&D.II.5:Vías de síntesis y catabolismo de poliaminas. Los genes indicados codifican para las enzimas: speA, arginina decarboxilasa; speB, agmatinasa; speC, speF, ornitina decarboxilasas; speD, S-adenosilmetionina (SAM) decarboxilasa; speE, espermidina sintasa; patA, putrescina transaminasa; patD, γ-aminobutiraldehído deshidrogenasa NAD-dependiente; gabT, γ-aminobutirato aminotransferasa; gabD, succinato semialdehido deshidrogenasa I. En rojo se indican los genes que se encontraron reprimidos en el ensayo de microarreglos (tabla R&D.II.1).
ayudar a neutralizar el pH en el medio mediante la excreción de poliaminas (298, 299). También se ha reportado un nuevo transportador de putrescina PuuP, como una de las proteínas involucradas en la vía de utilización de putrescina (300). Además, la espermidina es excretada a través de MdtJI cuando esta poliamina se sobreacumula en E. coli (301).
Los resultados obtenidos del análisis de los operones gabDTPC y potFGHI se visualizan en la tabla R&D.II.6. Para el primero de ellos, el sitio de unión predicho para PhoP se ubica en el marco de lectura del gen gabT; mientras que para el caso de los genes pot, la caja PhoP encontrada está localizada en la secuencia codificante para el gen potH. Si bien es necesaria la correcta verificación, estos resultados son llamativos dado que las supuestas cajas de unión al regulador de respuesta se encuentran dentro o corriente abajo de los genes que se identificaron como reprimidos en el ensayo de microarreglos (gabT, gabD, gabP, potF y potH). Por último, no se encontraron secuencias probables de unión a PhoP en las regiones promotora o codificante del gen gsp.
FIGURA R&D.II.6:Sistemas de transporte de poliaminas. Las letras indican la proteína Pot correspondiente. ESP, espermidina; PUT, putrescina; Orn, ornitina; CAD, cadaverina; Lis, lisina; MI, membrana interna. Los genes que se encontraron reprimidos en el ensayo de microarreglos (tabla R&D.II.1) codifican para las proteínas PotF y PotH.
Más allá de estos resultados, se decidió ampliar la búsqueda de genes regulados por la proteína PhoP a aquellos relacionados con la síntesis de putrescina. Se analizó la secuencia de los genes speA, speB, speC, speED y speF-potE. No se obtuvieron resultados positivos excepto para los casos de speB y speF-potE, si bien para éstos últimos la caja predicha de unión al regulador de respuesta se ubica dentro del marco de lectura del gen potE, por lo que no se continuó con su análisis. Sin embargo, en el caso de speB (que codifica la enzima encargada de la conversión de agmatina en putrescina, con la concomitante liberación de urea, figura R&D.II.5) se detectó un sitio putativo de unión a PhoP a 72 pb respecto al ATG de inicio de la traducción (tabla R&D.II.6). Más aún, una búsqueda en los resultados del ensayo de microarreglos muestra que la expresión de speB se encuentra disminuida (valores M de -2,15, -2,13 y -1,45) en un fondo phoP respecto al entorno salvaje.
Se ha visto que las poliaminas son requeridas para la virulencia en S. Typhimurium (302, 303). En estudios del perfil de expresión génica de S. Typhimurium intracelular se ha revelado que la expresión de genes para la captación de putrescina y espermidina está activada durante la infección de células epiteliales y macrófagos. Además, una mutante en la síntesis de poliaminas es defectiva en la invasión, la sobrevida intracelular, la muerte del nematodo Caenorhabditis elegans y la infección sistémica en un modelo murino de fiebre tifoidea (302). La invasión y sobrevida intracelular pueden ser complementadas por la adición de putrescina y espermidina exógena al medio de crecimiento previo a la infección, indicando que
TABLA R&D.II.6:Cajas putativas de unión al regulador transcripcional PhoP. Se indica en negrita los motivos consenso encontrados en la región promotora o dentro de la secuencia codificante de los genes u operones, mediante el análisis con el servidor MAST. En números se indica la distancia en pares de bases, corriente arriba o corriente abajo, respecto al codón de inicio de la traducción (ATG).
la supervivencia intracelular. En este sentido, se ha demostrado que la expresión de los genes de los mayores locus de virulencia, SPI-1 y SPI-2, se activa frente a la presencia de poliaminas exógenas, mientras que se encuentra reducida en una mutante, indicando que estos compuestos funcionan como señales en las cascadas regulatorias que controlan la expresión de genes de virulencia en S. Typhimurium (302).
3. c. Mecanismo de sensado de la densidad de población celular (quorum