El transporte en el interior de las células se da por vesículas. Un claro ejemplo de esto es el transporte de la carboxipeptidasa, que es transportada en forma de proenzima por el interior de la célula, en el interior de vesículas.
El proceso de formación de vesículas consta de 6 etapas básicas: 1. “Sorting” o clasificación
2. Vesiculación o “budding”
Se requieren proteínas de cubierta “coat” ccv: clathrin coated vesicles
cop I y II: Permiten el transporte entre el RE y el Golgi y por el interior de Golgi
3. Desprendimiento de la cubierta
Las proteínas de cubierta se desprenden una vez formada la vesícula. 4. Direccionamiento o transporte
5. Reconocimiento de la membrana receptora o diana
Se trata de las proteínas conocidas como SNARE, de la que encontramos 2 tipos t y v, target y vesicular. Son las proteínas de reconocimiento.
6. Fusión CLATRINA
Está formada por 6 cadenas polipeptídicas, formando una estructura que se conoce como trischelion. Cuando polimeriza el trischelion se obtienen estructuras hexagonales. A continuación se muestra una reconstrucción tridimensional de la clatrina, formando una vesícula. En
el dibujo la cubierta exterior está formada por 12 pentágonos y 6 hexágonos. En rojo se muestran las patas superpuestas de los trischelions, mientras que el verde muestra los dominios terminales de la clatrina. La parte interna azul muestra las proteínas adaptadoras, que ya se verán más adelante. La cubierta mostrada es muy pequeña para contener una
vesícula, pero el diseño en una vesícula es similar. El dibujo mide 50 nm de lado. La clatrina se aisló a partir de lo que se conocía como “coated pits”.
La clatrina no se une directamente a la membrana, sino que lo hace mediante adaptadores, formados por 4 tipos de proteínas diferentes. Adaptadores de tipo I: α y β. Adaptadores de tipo II: β y γ. Los adaptadores pueden reconocer a los receptores y/o a la membrana. Existen 3 tipos de adaptadores. Existen diferencias en las posibilidades de maduración. α puede madurar de 5 maneras, β tiene diferentes posibilidades. Se tratan básicamente de familias de proteínas.
En principio se creía que había sólo 1 tipo de clatrina, pero actualmente se sabe que hay como mínimo 3 tipos diferentes. Según se va uniendo la clatrina, irá sufriendo cambios conformacionales, lo que provocará que se forme una estructura en forma de cúpula, lo que provocará la aparición de las vesículas. Actuará entonces la hsp70, desplegando la clatrina, separándola y secuestrándola hasta que vuelva a ser necesaria.
COP
Las proteínas CoP de tipo I fueron identificadas por Rothmann cuando estaba intentando hacer un modelo de transporte intragolgi. Trabajaba con 2 líneas celulares, la A con una mutación en NAcGln transferasa, es decir, la célula I, defecto que se sitúa en el cis Golgi, y la línea B, que tenía un defecto en la glucosilasa situada en el trans, que es la encargada de separar NAcGln. Trabajando con Golgi extraídos de estas células observó que se producía una correcta síntesis de los enzimas, ya que pasaban de una Golgi a otro. A partir de esto identificó el coatómero. Está compuesto por 7 proteínas diferentes: α, β, γ, δ, ε, p20 y ARF1, ADP ribosilation factor; es el elemento regulador, se trata de una small GTPasa.
Se observaron más adelante otras vesículas que iban del RER al Golgi. Estas vesículas no tienen los coatómeros CoP I, sino que poseen coatómeros CoP II. No existen las proteínas CoP, sino que hay dos complejos, sec 13 y sec 23, que son estrucuturalmente similares a CoP. Además hay otra proteína pequeña, la SarI, de 20Kda, que actúa como regulador. Se trata de una small GTPasa.
Para que se forme la vesícula, se une ARF a la membrana, mediante una cola lipófila. ARF reclutará a los coatómeros. Una vez se une ARF, recibe de la proteína intercambiadora de nucleótidos un GTP, con lo que la unión a membrana será más fuerte y se reclutarán los coatómeros. El desprendimiento de la cubierta se suele dar por hidrólisis del GTP unido a ARF. Las membranas con CoP II se suelen formar de manera similar.
Localización de las distintas vesículas
Las vesículas formadas por CoP I son las encargadas del transporte en el interior del Golgi. Son las únicas que se han encontrado en modelos “in vitro” de Golgi. CoP II es la encargada del transporte desde e RE al Golgi, pero parece muy posible que CoP I también intervenga en ese proceso.
A principios de los 80, Rothmann trató su modelo con N – etilmaleimida, con lo que el modelo dejaba de funcionar. Identificó por lo tanto un factor sensible a la N etilmaleimida, el NSF; N – etilmaleimida sensitive factor. Mientras tanto, Schekman aisló una proteína similar a NSF, que era sec 18, que si se ponía en el modelo que no funcionaba, sec 18 sustituía a NSF, y el modelo funcionaba. También se identificaron otras proteínas, un complejo de unión a NSF, las SNAPs (α, β y γ). SNAP α es homóloga a sec 17, mientras que sec 4 resultó ser homóloga a ras, una GTP binding protein.
Se identificaron muchas proteínas homólogas a ras, que se asociaron con vesículas en células animales. Entre estas se han de destacar:
Ras
Rac, Rho, CDC42
Rab (“ras genes from rat brain”) En todas las proteínas pequeñas de unión a GTP se da la siguiente reacción:
GTP
Rab
GDP
Rab
GDP NEF−
←
→
−
Esas proteínas actúan sobre otros complejos de proteínas, estabilizándolos. Se identificaron muchas proteínas similares, a las que se denominó Rab. Hasta ahora tenemos por lo tanto, 3 factores implicados: NSF, SNAP y rab.
Neurofisiólogos identificaron entonces algunas proteínas de la terminales sinápticas y de las vesículas, a las que llamaron syntaxin, situada en la membrana plasmática, que se une a synaptotagmina, situada en la vesícula. Syntaxin es también homóloga a SED 5, también situada en la membrana plasmática. Otra proteína que identificaron fue VAMP, que es esencial para la unión de vesículas secretoras a la membrana y que es la diana de dos neurotoxinas. Observaron entonces con NSF y SNAP, que estas moléculas tenían una elevada afinidad por VAMP y syntaxin. Llamaron a este tipo de moléculas, similares a VAMP y a syntaxin SNAREs; SNAPs receptors. Existen 2 tipos de SNAREs diferentes v y t, vesicular y target. Las vesículas unidas a SNARE serán capaces de unirse a la membrana, siempre y cuando haya reconocimiento entre SNAREs. Existe una proteína Rab, que va unida a la vesícula, unida a GDP. Cuando se produce el reconocimiento de ambas proteínas de unión, se cambiará el GDP por un GTP, estabilizando la unión.
La toxina botulínica, mortal para humanos en concentraciones fentomolares, destruye el complejo SNARE vesicular, con lo que no habrá reconocimiento de la membrana, por lo que no habrá contracción muscular, ni respiración, ni función cardiaca...
Cuando se da la fusión con la membrana, el SNARE queda unido a la membrana del receptor, por lo que se deberá reciclar.