IN VITRO
2.2.2.1.- LUGAR DE TRABAJO
Los estudios del efecto clínico antiiflamatorio se realizaron en las instalaciones del a Sociedad Rural de General Paz, Provincia de Buenos Aires.
2.2.2.2.- ANIMALES
Para este estudio fueron utilizados cuatro equinos, de raza mestiza de entre 3 y 4 años de edad con un peso promedio de 300 ± 20 Kg.
Los animales experimentales fueron estabulados individualmente desde el mes previo al comienzo del estudio. Diariamente (exceptuando los días de trabajo experimental) a las 8.00 AM los animales eran llevados a un piquete de 700 m² hasta las 8.00 PM momento en el cual eran conducidos a sus establos.
Todos los animales tuvieron acceso libre a agua potable y fueron alimentados con 3 raciones diarias compuestas por avena y forraje de excelente calidad.
2.2.2.3.- CRITERIOS DE INCLUSIÓN DE LOS ANIMALES
Los equinos utilizados en el presente estudio fueron incorporados en base a los siguientes criterios de inclusión.
¾ Edad superior a 2 años
¾ Correcto estado nutricional
¾ Hembras no gestantes
¾ No haber sufrido ningún procedimiento quirúrgico articular previo.
¾ No padecer o haber padecido enfermedades sistémicas de origen inmune
¾ No estar recibiendo medicación de ninguna clase
¾ No presentar problemas artríticos. 2.2.2.4.- DISEÑO EXPERIMENTAL
Se aplicó un diseño de cuadrado latino de dos fases (Tabla 1) de manera tal, que cada animal experimental recibiera tratamiento placebo, y tratamiento con la formulación que demostró las mejores características de acuerdo a los estudios anteriores (FORMULACION 2: diclofenac dietilamina al 2%, como principio activo, y ácido oleico al 15% como mejorador de la penetración).
Entre cada fase del estudio se dejo transcurrir un periodo de 2 semanas a efectos de asegurar la eliminación de concentraciones efectivas de fármaco.
Todos los parámetros clínicos fueron determinados a 3, 6, 9, 12, 24, 36, 48, 72, 96 y 120 h.
Diseño cuadrado latino de dos fases:
FASE 1 FASE 2
Individuo Tratamiento Individuo Tratamiento
A PL A DFD
B DFD B PL
C PL C DFD
D DFD D PL
DFD: Diclofenac dietilamina (formulación 2); PL: Placebo
2.2.2.5.- MODELO EXPERIMENTAL
La superficie de administración fue delimitada de acuerdo a los límites topográficos de la articulación del carpo:
Límite proximal: las apófisis estiloides del radio.
Límite distal: una línea que une las cabezas de los metacarpianos.
La superficie total del área delimitada fue estimada considerando a la misma como un cilindro (circunferencia x altura). La superficie total de aplicación de las formulaciones fue calculada en 450 cm2 (circunferencia =30 y altura 15 cm).
El día previo al inicio de cada fase experimental la superficie dorsal de la articulación carpiana de ambos miembros de todos los animales experimentales fue rasurada y lavada con agua y jabón.
A tiempo 0 se inyectó intraarticularmente 1ml de PBS conteniendo 1µg de LPS (Escherichia coli O55:B5 (Sigma Chemical Co, St Louis USA). Transcurridas 48 h se inyectó una segunda dosis de 0,1 µg de LPS contenido en 0,1ml de PBS (Palmer y Bertone, 1994).
La administración de los tratamientos de inició inmediatamente después de la 1ra inyección de LPS.
En las fases 1 la artritis se indujo en el carpo izquierdo, mientras que en la fase 2 se utilizó la articulación del miembro opuesto.
2.2.2.6.- APLICACIÓN DE TRATAMIENTOS
Los animales experimentales fueron divididos en 2 grupos. El grupo tratado recibió epicutaneamente 20 gramos totales de la formulación A cada 6 h (equivalente a 1.04 mg/cm2/6h) por un período de 5 días. El grupo control recibió, por la misma vía, 20 g totales de la formulación placebo con el mismo esquema de dosificación.
La homogénea distribución de las formulaciones fue asegurada a través de un masaje suave de 2 minutos de duración. Previamente a la segunda administración así como, en las administraciones subsiguientes, el sitio de administración fue higienizado varias veces con una solución acuosa de clorhexidina 0,05%.
2.2.2.7.- EVALUACION CLINICA DEL EFECTO ANTIINFLAMATORIO
El efecto antiinflamatorio de las formulaciones ensayadas fue evaluado a través de los siguientes parámetros clínicos: Largo de paso; ángulo carpiano en estación y en flexión máxima y circunferencia carpiana.
Mediciones de control fueron efectuadas en los días previos a la administración así como, el mismo día antes de la administración de los tratamientos (-60 a -30min), a efectos de construir una línea basal de los diferentes parámetros clínicos evaluados.
2.2.2.7.1.- LARGO DE PASO
El largo de paso fue determinado haciendo caminar al caballo sobre un papel extendido en una superficie dura y midiendo la distancia entre las pisadas del miembro afectado. Diez pasos consecutivos fueron medidos con una cinta métrica flexible. El primero y el último fueron descartados, tomándose el promedio de los ocho restantes. El valor basal del largo de paso fue el promedio de 10 determinaciones realizadas 2 veces al día durante los 5 días previos al comienzo del estudio.
2.2.2.7.2.- ÁNGULO EN ESTACIÓN Y FLEXIÓN MÁXIMA
Estas mediciones fueron tomadas utilizando un goniómetro. Primero fue medido (en grados) el ángulo en reposo del miembro inflamado. Posteriormente, el miembro fue flexionado progresivamente hasta la aparición de una reacción de dolor momento en que se registró el valor en grados correspondiente a la flexión máxima.
2.2.2.7.3.- CIRCUNFERENCIA CARPIANA
La circunferencia carpiana fue medida en el punto medio de la articulación, usando una cinta métrica flexible con el miembro extendido (en posición normal erguida). Esta maniobra permite medir la circunferencia en milimetros.
2.2.2.7.4.- TEMPERATURA CORPORAL
La temperatura corporal fue determinada utilizando termómetro clínico digital (Citizen TM CT-513W) colocado en el ano hasta la determinación automática. El registro de este parámetro fue realizado en grados centígrados.
2.2.2.8.- ANÁLISIS ESTADISTICO
Los datos fueron analizados mediante análisis descriptivo calculándose las medias de tendencia central (promedio) y de dispersión (desvio estándar) de los parámetros mensurados.
Posteriormente se realizó un análisis inferativo aplicando análisis de varianza de dos vías tomando como fuente de variación el tratamiento y el individuo. Como parámetros de comparación se utilizaron las áreas bajo la curva porcentaje de cambio desde basal de cada individuo (100% corresponde al valor basal) en función del tiempo. El nivel de significancia fue establecido en 5%
Las áreas bajo la curva fueron calculadas aplicando la siguiente ecuación:
n-1
AUC= 0.5 ∑ (ti+1 - ti) (yi + yi+1) I=0
3.- RESULTADOS