AGENT PROPERTIES Autonomous
3.2.1.1 Improving Decentralised Decision Making with MAS
La via de señalización Wnt/β-catenina actúa como un importante modulador del crecimiento y función osteoblásticas, lo que justifica su interés en la osteopenia/osteoporosis diabética como avalan datos previos [231]. Además, un estudio reciente de nuestro laboratorio demuestra una disminución de la inmunotinción para β-catenina en osteoblastos y osteocitos en la tibia de ratones con DM1 inducida por STZ [176]. En este mismo estudio previo, se encontraron -mediante PCR arrays- alteraciones significativas en la expresión de algunos genes relacionados con esta vía [176]. Sin embargo, el patrón observado en estos cambios génicos no permitía concluir el verdadero estado de activación/inhibición de la vía Wnt en este modelo experimental. En la presente Tesis, hemos caracterizado las interacciones de la AG (característica del estado diabético) con los principales componentes de la vía Wnt/β- catenina en cultivos de células osteoblásticas in vitro. Utilizando esta aproximación experimental, hemos demostrado que la AG afecta a diferentes componentes de la vía Wnt canónica e induce la desestabilización de la β-catenina en las células osteoblásticas. Nuestros hallazgos también indican que la PTHrP –a través de sus dominios N- y C-terminal- es capaz de activar esta vía de señalización aun en presencia de AG.
WNT3a es un miembro importante dentro de la familia de proteínas WNT cuya deficiencia homozigótica produce efectos deletéreos en el esqueleto axial del ratón [232]. La expresión de este ligando activador de la vía Wnt/β-catenina se encuentra relacionada con la diferenciación osteoblástica [233]. Como se ha citado en la Introducción, las proteínas WNT señalizan interaccionando con el complejo formado por el receptor de membrana FZD y los co-receptores LRP5/6 [64]. Así, la disminución observada en la expresión de Wnt3a y de ambos co-receptores citados, junto al incremento en la expresión de inhibidores como Dkk1 y Axina2, inducidos por la AG en células osteoblásticas podría contribuir a la inactivación de β-catenina. Nuestros hallazgos demuestran que, a pesar de imprimar la vía Wnt/β-catenina con WNT3a, el efecto inhibitorio de la AG sobre esta vía de señalización se mantenía en las células osteoblásticas; indicando que la AG afecta a componentes más distales a este ligando. Por otro lado, se ha descrito la activación de p38-MAPK por la AG en estas células [197, 198, 234]. Sin embargo, la interacción entre las vías p38-MAPK y Wnt/β-catenina parece compleja y mal caracterizada. Por un lado, estudios en líneas celulares no óseas han demostrado que la p38 promueve la estabilización de la β-catenina a través de la fosforilación de los dominios PPPSP de LRP6 o inhibiendo a GSK3β [235, 236].
Por otro lado, existen evidencias a favor del papel inhibidor de p38 sobre la vía Wnt (con supresión de la actividad del gen final de la vía Lef1) en células osteoblásticas [237]. Cabe destacar que en estas células, la p38 ejerce una acción activadora sobre Osx, un factor inhibidor de la vía Wnt [238]. Así pues, la evidencia actual sugiere que la inhibición de esta MAPK favorecería la estabilización de β-catenina en las células osteoblásticas. Nuestros resultados utilizando un inhibidor farmacológico de p38 (SB203580) son coherentes con la hipótesis de que la AG activaría p38-MAPK, disminuyendo la actividad transcripcional de β-catenina/TCF en estas células.
Además, encontramos una disminución de p-GSK3 en células osteoblásticas expuestas a condiciones de AG. Como se ha comentado en la Introducción, la GSK3β
es una molécula clave en la modulación de la vía Wnt, en parte a través de su fosforilación por AKT [239]. De este modo, nuestros resultados podrían justificarse por una disminución de AKT en su forma activa por la AG. De hecho, existen evidencias a favor de este mecanismo asociado a la AG: 1) el aumento de PTEN (inhibidor de PI3K/AKT) por la AG en células osteoprogenitoras de rata [240]; los niveles bajos de AKT activa (coincidente con un incremento de p38-MAPK) en pacientes con nefropatía diabética [241]; y 3) la inhibición de los efectos deletéreos de la AG en células osteoblásticas por la hesperidina o el resveratrol a través de la activación de la vía PI3K/AKT [242, 243]. En contraposición con estos hallazgos, se ha descrito que la AG es capaz de activar AKT, promoviendo la diferenciación adipogénica de osteoblastos primarios de rata [244]. Así pues, los efectos de la AG sobre AKT (inhibición o activación) parecen depender del tipo y estadío de diferenciación celular [240]. En la presente Tesis, con objeto de determinar si la acción efectora final de la AG sobre la vía Wnt/β-catenina recaía en el bloqueo de la fosforilación de GSK3β empleamos LiCl, que promueve directamente la fosforilación (inactivación) de esta enzima GSK3β y también activa AKT [245, 246]. Aunque en células mesangiales el LiCl revierte el efecto supresor de la AG sobre la vía Wnt [247], observamos que este tratamiento fue ineficaz para revertir la desestabilización de β-catenina o la inhibición de su actividad transcripcional por la AG en las células osteoblásticas. Así pues, la AG parece afectar negativamente a la vía Wnt/β-catenina posteriormente a la activación de GSK3β, posiblemente promoviendo la degradación de β-catenina en estas células. De hecho, la AG no disminuyó la actividad transcripcional TCF característica de la activación de la vía Wnt en células osteoblásticas que sobreexpresan una β-catenina mutada no degradable.
Una posible vía de actuación de la AG en las células óseas es a través de la elevación del estrés oxidativo, que induce la activación de p38-MAPK [248], así como la de FoxO [249, 250]. Los factores de transcripción de la familia FoxO ejercen
diferentes funciones entre las que se encuentra la defensa frente al estrés oxidativo. En el hueso, se expresan FoxO1, 3 y 4 que, en presencia de ROS, son fosforilados por enzimas como JNK quinasa, MST1 y p38-MAPK induciendo su translocación al núcleo [251-253]. En éste, la formación del complejo FoxO/β-catenina desvía a ésta última de su unión a TCF (impidiendo su acción osteogénica) y favorece su interacción con secuencias concretas de promotores de genes relacionados con el ciclo celular (p21,
p27, CiclinaG2), enzimas de defensa frente a ROS (catalasa, SOD), la reparación de
ADN (Gadd45) y la apoptosis (Bim1, FasL) [254]. Los datos obtenidos en esta Tesis apoyan la hipótesis de que el estrés oxidativo inducido por AG, a través de la activación de FoxO, contribuiría a la disminución de actividad de la β-catenina en células osteoblásticas.
Considerando el importante papel de la via Wnt canónica, como modulador de la proliferación y función osteoblástica, presenta interés su estudio como posible diana terapéutica de agentes osteogénicos. En esta Tesis, hemos demostrado que ambos fragmentos N- y C-terminal de la PTHrP son capaces de activar la vía Wnt y estabilizar a la β-catenina en un entorno de AG. Los datos obtenidos in vitro no permiten descartar que la PTHrP también pudiera interaccionar con inhibidores endógenos de la vía Wnt canónica, como DKK1 y Sost/esclerostina, para promover su activación en osteoblastos expuestos a AG. De hecho, se ha demostrado previamente que la PTHrP, de modo similar a la PTH, disminuye la expresión basal de ambos inhibidores en células de osteosarcoma de rata (UMR-106) [255, 256]. Aunque se ha demostrado expresión de Dkk1 en ciertos clones celulares de MC3T3-E1 [257], en el presente trabajo no hemos podido detectar dicha expresión con sondas TaqMan MGB (Applied Biosystems) o cebadores específicos del gen Dkk1 de ratón en la cepa utilizada de esta línea celular. Por ello, resulta improbable que la estabilización de la β-catenina inducida por la PTHrP en nuestro estudio se deba a una disminución de la expresión de DKK1. Estudios recientes también indican que la activación del PTH1R puede desencadenar la estabilización de la β-catenina de manera independiente a la señalización por proteínas Wnt, bien mediante el reclutamiento de Dvl y la activación de la PKA [258], o bien por la formación de un complejo con LRP6 (que es rápidamente fosforilado) y la axina (inhibidor de la vía Wnt) [259]. Cualquiera de ambos mecanismos podría contribuir a la estabilización de la β-catenina por la PTHrP (1-36), que interacciona con el PTH1R con la misma afinidad que la PTH en células osteoblásticas [148]. De hecho, en la presente Tesis encontramos que la PTH (1-34) resultó tan eficaz como la PTHrP (1-36) para estimular la expresión de genes diana de la β-catenina en las células MC3T3-E1 expuestas a AG. Por otro lado, este efecto estimulador inducido por la PTHrP (107-139) se observó incluso a dosis inferiores al
rango de nM en estas células; de acuerdo a la estimulación previamente observada en otro gen (OPG) controlado por β-catenina [162].
Nuestros resultados sugieren que la PKA y la PKC actuan como mediadores del efecto estimulador de la PTHrP (1-36) y de la PTHrP (107-139), respectivamente, sobre la activación de la β-catenina en las células osteoblásticas. El papel del sistema AMPc/PKA en esta acción de la PTHrP (1-36) es coherente con datos previos en otra línea celular osteoblástica utilizando la PTH como agonista [256]. Por otro lado, AMPc/PKA y PKC han demostrado ser mediadores importantes de diversas acciones osteoblásticas de la PTHrP (1-36) y la PTHrP (107-139), respectivamente [164, 167, 260].