Los métodos de purificación de proteínas más comúnmente utilizados incluyen precipitación y cromatografía de intercambio iónico, de afinidad y de exclusión (Bonnerjea y col., 1986). La selección y el orden en el que se apliquen dependerá de la información de que dispongamos respecto de la proteína diana, tales como la estabilidad a diferentes pHs, sales o temperaturas, sensibilidad a proteasas, peso molecular, punto isoeléctrico, solubilidad, hidrofobicidad, afinidad por determinados sustratos, etc. En el caso de los péptidos antifúngicos la hidrofobicidad y la estructura en α-hélice se correlacionan con la toxicidad para las células de mamíferos, mientras que la carga positiva afecta más al efecto antifúngico (Hong y col., 2001).
I.6.2.1. SEPARACIÓN POR PRECIPITACIÓN.
La solubilidad de las proteínas en diferentes soluciones depende de la concentración de la misma y de la carga de los aminoácidos en la molécula, por lo que puede modificarse en función del pH o la temperatura.
La precipitación con sulfato amónico ((NH4)2SO4) permite extraer y concentrar proteínas de manera eficaz, por lo que es una técnica que puede utilizarse en las primeras etapas de la purificación proteica (Wang y Ng, 2001a). No obstante, el extracto obtenido contiene una elevada concentración de sal que debe eliminarse posteriormente mediante diálisis, ultrafiltración o columnas de desalado.
La utilización de solventes orgánicos permite fraccionar proteínas en función de la solubilidad en los mismos, aunque muchos péptidos podrían desnaturalizarse (Khmelnitsky y Rich, 1999), por lo que no es una técnica muy adecuada si se requiere recuperar posteriormente la actividad de la proteína diana.
INTRODUCCIÓN
I.6.2.2. SEPARACIÓN POR ADSORCIÓN.
La adsorción cromatográfica se basa en la separación de compuestos en función de la diferente afinidad a un soporte sólido y a un solvente móvil.
La cromatografía de intercambio iónico se basa en una interacción reversible entre una proteína cargada y un soporte con carga opuesta. Posteriormente las proteínas se eluyen selectivamente de la columna mediante el incremento de la fuerza iónica o cambios en el pH. Es la técnica más frecuentemente utilizada para la purificación de proteínas (Bonnerjea y col., 1986), ya que pueden utilizarse volúmenes de muestra muy variables. En los péptidos antifúngicos específicos para las membranas de los hongos desempeña un papel destacado la carga (Hoover y col., 2003) y el carácter catiónico o hidrofóbico (Friedrich y col., 1999; Hancock y Chapple, 1999) del compuesto. Por lo tanto, la cromatografía de intercambio iónico resulta muy útil para la purificación de los péptidos con actividad antifúngica (Lacadena y col., 1995; Marx y col., 1995; Martínez-Ruiz y col., 1997; Lee y col., 1999; Wang y Ng, 2001a,b, 2003; Chu y col., 2003).
La cromatografía de afinidad separa proteínas en función de una interacción reversible con un ligando inmovilizado covalentemente en la matriz de la columna (Dean y col., 1985). La desorción se lleva a cabo de manera específica mediante el uso de ligandos competitivos, cambios en el pH, en la fuerza iónica o en la polaridad. Esta técnica ofrece una gran especificidad, por lo que suele ser de gran utilidad cuando se conoce el compuesto a purificar. De hecho, se utiliza con frecuencia para la obtención de proteínas con actividad antifúngica a partir de vegetales (Van den Berg y col., 2002; Wang y Ng, 2001a,b, 2003; Chu y col., 2003). Por el contrario, cuando se desconocen los compuestos activos no es tan útil, al no disponerse de matrices comerciales aplicables a la purificación de gran
INTRODUCCIÓN
La cromatografía en fase reversa se utiliza para separar proteínas en función de su hidrofobicidad. Debido a la naturaleza de las matrices utilizadas, la unión es normalmente tan fuerte que requiere el uso de solventes orgánicos para la elución, por lo que muchas proteínas pueden desnaturalizarse (Khmelnitsky y Rich, 1999). Es una técnica muy selectiva y de alta resolución, por lo que suele utilizarse en las últimas fases de la purificación proteica (Marx y col., 1995; Lee y col., 1999; Gomes y col., 1995), y siempre que no se requiera una recuperación posterior de la actividad de la proteína diana.
El cromatoenfoque es una variante de la cromatografía de intercambio iónico (Sluyterman y Kooistra, 1989). Mediante la generación de un gradiente de pH in situ se concentran las moléculas por su punto isoeléctrico. Se utiliza para determinar el punto isoeléctrico de las proteínas purificadas (Moyne y col., 2001).
I.6.2.3. SEPARACIÓN POR TAMAÑO.
La separación tiene lugar en función del peso molecular y de la conformación de las proteínas, lo que determina su paso a través de unos poros de diámetro conocido.
La ultrafiltración permite la separación de proteínas en función del tamaño mediante membranas con diferentes límites de corte. No obstante, se han descrito multitud de proteínas antifúngicas de tamaños muy variables, por lo que es una técnica que no resulta muy útil si se desconoce el tamaño de la proteína diana.
La cromatografía de exclusión o filtración en gel es una técnica basada en la capacidad de una molécula para penetrar a través de los poros de las partículas del gel, lo que permite separar proteínas en función de su peso molecular (Borman, 1983). Aunque suele utilizarse para desalar extractos obtenidos mediante precipitación con diferentes sales, es ideal para las últimas etapas de purificación (Lacadena y col., 1995; Martínez-Ruiz y col., 1997; Wang y Ng,
INTRODUCCIÓN
2001a,b, 2003; Chu y col., 2003; Gomes y col., 2005) ya que el volumen de muestra influye significativamente en la resolución. Además permite realizar una estimación del peso molecular de la proteína diana mediante el uso de patrones.
I.6.2.4. SEPARACIÓN POR ELECTROFORESIS.
La electroforesis en gel de poliacrilamida puede utilizarse para separar proteínas en función de su carga y tamaño, mediante electroforesis no desnaturalizantes o nativas (Bonnerjea y col., 1986); o bien sólo en función del tamaño de sus subunidades, mediante electroforesis desnaturalizantes (Weber y Osborn, 1969). Las matrices sólidas discontinuas son las más utilizadas y constan de dos geles, uno concentrador con gran tamaño de poro y otro separador cuyo tamaño de poro dependerá del peso molecular de las proteínas a separar (Ornstein, 1964; Laemmli, 1970).
Muchos autores han utilizado estos geles para comprobar la pureza y calcular el peso molecular de la proteína purificada (Lacadena y col., 1995; Marx y col., 1995; Martínez-Ruiz y col., 1997; Lee y col., 1999; Wang y Ng, 2001a,b, 2003; Chu y Ng, 2003). También es un paso previo a la fijación en membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de las proteínas a secuenciar.
La electroforesis capilar en gel permite separar proteínas y péptidos de peso molecular alto (Grossman y col., 1989; Ganzler y col., 1992) mediante la aplicación de un alto voltaje sobre un capilar relleno de un gel de poliacrilamida o matrices de polímeros de dextranos a través del que se separa la muestra. Los compuestos son posteriormente identificados y cuantificados mediante diferentes detectores, siendo los de ultravioleta y de fluorescencia los más utilizados (Swedberg, 1997). El volumen de muestra analizado así como el que se obtiene tras el análisis es muy pequeño, por lo que es una técnica que puede ser útil en las
INTRODUCCIÓN