Integrated TTF Dimensions with TAM Constructs

Los volúmenes de TRL obtenidas a partir del suero, fueron ajustados a 1.5 ml de volumen final con una solución de cloruro potásico (KCl) 0.1 M (Merck, Darmstadt, Alemania). Seguidamente, los lípidos totales fueron extraídos siguiendo una modificación del método de Folch et al. [412], como se describe a continuación.

Las TRL se colocaron en un tubo cónico y se añadieron 5 ml de cloroformo:metanol (2:1, v/v) (BDH/Prolabo, París, Francia). Tras agitarse vigorosamente durante 1 minuto, los tubos permanecieron en reposo hasta separarse dos fases bien diferenciadas con una pequeña interfase entre ambas. En caso de no obtener dicha separación, se añadieron varias gotas de KCl 0.1 M y se agitó vigorosamente de nuevo, seguido de un período de reposo. Con el fin de favorecer el proceso de separación de las fases, se centrifugó a 3.000 rpm durante 10 minutos y se obtuvieron tres fases: en la parte superior, la fase metanólica o hidroalcohólica, formada por metanol y la solución de KCl; en el centro, la interfase, que contenía precipitados de proteínas, y puede presentar lípidos adsorbidos sobre éstas; y por último, en la parte inferior se encontraba la fase clorofórmica que contenía los lípidos.

La fase clorofórmica fue recogida y filtrada sobre un papel de filtro Whatman nº1 (Whatman Paper Ltd., Maidstone, Reino Unido) que contenía sulfato sódico anhidro (Merck, Darmstadt, Alemania), con el objeto de retener las trazas de agua que pudieran haber sido

arrastradas, y se colocó en un tubo para evaporador.

La fase acuosa fue lavada con 2 ml de la mezcla cloroformo:metanol (2:1, v/v) que se añadieron al tubo original. Los tubos se agitaron vigorosamente durante 1 minuto y se centrifugaron de nuevo a 3.000 rpm durante 10 minutos en una centrífuga de rotor vasculante (Eppendorf Centrifuge 5804R, Hamburg, Alemania). La fase clorofórmica se recogió y se añadió a la obtenida anteriormente tras su filtración.

Una vez finalizada la segunda extracción, el extracto clorofórmico fue evaporado a sequedad con ayuda de un rotavapor (Büchi Labortechnic AG, Flawil, Suiza) a una velocidad de rotación de 160 rpm. El rotavapor estaba acoplado a un baño con agua destilada a 40 ºC y a una bomba de vacío para acelerar el proceso.

Los lípidos obtenidos se redisolvieron en 0.5 ml de cloroformo:metanol (2:1, v/v), del cual se tomó una alícuota de 200 µl para la separación de TG y FL mediante extracción en fase sólida (Solid Phase Extraction, SPE). Los viales, herméticamente cerrados con tapón de teflón, se mantuvieron a -20 ºC, en atmósfera de nitrógeno para evitar la oxidación de los lípidos hasta el momento de su procesamiento.

3.2.2 Separación de fracciones de lípidos mediante extracción de fase sólida

Los TG y FL presentes en la fracción de lípidos totales se aislaron mediante extracción en fase sólida (SPE). Esta técnica está basada en el mismo principio que la cromatografía líquida, por lo que en el interior de dichas columnas tienen lugar fuertes interacciones de tipo reversible entre el analito y la fase estacionaria. Los procesos de separación en fase normal implican: un analito polar disuelto en una matriz de polaridad media o no polar y una fase estacionaria polar, formada por grupos polares unidos a una superficie de sílice. La retención de un determinado analito bajo las condiciones de una columna normal se debe, principalmente, a interacciones entre los grupos funcionales polares del analito y los grupos polares sobre la superficie del adsorbente. Los compuestos absorbidos por estos mecanismos son eluídos al pasar a través de la columna un solvente que altere su mecanismo de unión, normalmente un solvente más polar que la matriz original de la muestra.

En nuestro estudio se emplearon columnas de fase normal tipo LC- Diol que presentan grupos hidroxilo unidos a la sílice (SupelcleanTM LC-Diol, Supelco, Bellefonte, EEUU) con 3 ml de capacidad y 45 µm de tamaño de partícula. Las columnas LC-Diol se colocaron en un sistema de elución acoplado a una bomba de vacío y se acondicionaron lavando con dos volúmenes de hexano (3ml x 2), evitando que la columna volviera a sequedad tras el segundo lavado. A continuación, se dispusieron 200 µl de lípidos totales sobre las columnas. Una vez entró la muestra en contacto con la columna, se añadieron dos volúmenes de hexano:cloruro de metileno (9:1, v/v) (VWR Chemicals, Int., EEUU ) y se dejaron pasar por la columna para recoger los TG eluídos en el tubo correspondiente.

Para obtener los FL se añadió un volumen de metanol seguido de otro volumen de acetona (VWR Chemicals, Int., EEUU), que tras su paso a través de la columna arrastraron los FL eluyéndolos en los tubos preparados para tal efecto. Finalmente, se lavó la columna con cinco volúmenes de acetona y se secó bajo corriente de nitrógeno.

Los TG y FL obtenidos fueron llevados a sequedad bajo corriente de nitrógeno y se redisolvieron en 500 µl de cloroformo:metanol (1:1, v/v). Los TG y FL aislados serán empleados para el análisis de los ésteres metílicos de AG mediante la técnica de cromatografía de gases (CG).

3.2.3 Análisis de ésteres metílicos de AG de triglicéridos y fosfolípidos

La determinación de la composición de AG de TG y FL se llevó a cabo mediante cromatografía de gases (GC). La GC es una técnica cromatográfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La CG se desarrolla en una columna cerrada en la que se encuentra retenida la fase estacionaria y por la que se hace pasar el gas portador, siendo la técnica de separación la elución. Iniciado el proceso cromatográfico los componentes de la mezcla se distribuyen entre la fase estacionaria y la fase móvil, por lo que la elución tiene lugar forzando el paso de un gas inerte a través de la columna. A diferencia de otros tipos de cromatografía la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito y su única función es la de transportar la muestra a través de la columna.

Para ello, los AG fueron previamente derivatizados a ésteres metílicos de ácidos grasos (fatty acid methyl esters, FAME) de bajo punto de ebullición, siguiendo el procedimiento de metilación en caliente basado en el método B del anexo 10 contenido en el Reglamento de la UE CE 2568 /91 (punto 4.2 del método IUPAC nº 2.301). El principio por el que se obtienen los FAME a través de este método se basa en una neutralización de los AG libres y una metanólisis de los glicéridos, seguida de una esterificación de los AG en medio ácido.

Con este fín, las alícuotas de 200 µl de TG y FL fueron transferidas a tubos de metilación, donde el disolvente fue evaporado a sequedad en corriente de nitrógeno empleando un evaporador conectado a corriente de nitrógeno (Techne Dri-Block DB-3D, Bibby Scientific Limited, Stone, Reino Unido). Tras añadir un plato poroso a los tubos de metilación, las fracciones lipídicas fueron saponificadas por la acción de 10 ml de metóxido sódico (Alfa Aesar, Massachusetts, EEUU) a una concentración del 0.5% en metanol anhidro (m/v) y calentamiento durante 30 minutos a 80ºC en un termobloque (Grupo-Selecta, Barcelona, España). Los FAME se formaron tras una neutralización con aproximadamente 2 ml de ácido sulfúrico (Sigma Aldrich, Missouri, EEUU) al 6% (v/v) en metanol anhidro, que se visualizó gracias a la presencia de fenolftaleína (Scharlau, Barcelona, España) añadida previamente; y después de un segundo calentamiento de 10 minutos a 80ºC, en el caso de FL fueron otros 30 minutos. Tras atemperar los tubos, con el fin de favorecer la separación de las distintas fases para el proceso de extracción, se añadieron 6 ml de una disolución saturada de NaCl (Sigma-Aldrich, Missouri, EEUU ) y se agitó suavemente. Para la extracción de los FAME se añadieron 2 ml de hexano, se agitó vigorosamente, y tras un período de reposo se recogió la fase superior (hexano). Esta operación se repitió dos veces más para optimizar la extracción. El hexano recogido se evaporó a sequedad en corriente de nitrógeno y los FAME se redisolvieron en 100 µl de hexano. Los FAME se mantuvieron bajo refrigeración en tubos herméticamente cerrados hasta proceder con el análisis cromatográfico.

Un volumen de 2 µL de los FAME resultantes fueron inyectados en el cromatógrafo de gases con la ayuda de una microjeringa integrada en un inyector automático Hewlett- Packard 6890 Series (Hewlett-Packard, Avondale, EEUU) acoplado a un cromatógrafo de gases Hewlett- Packard 5890 Series II (Hewlett-Packard, Avondale, EEUU) y controlado por una estación de datos ChemStation Rev. A-03-02 (Hewlett-Packard, Avondale, EEUU). El cromatógrafo, equipado con un detector de ionización de llama (Flame Ionization Detector, FID) separó los

Victoria, Australia) de 10 m de longitud, 0.1 mm de diámetro interno y 0.2 µm de film de recubrimiento interior. Como gas portador se empleó nitrógeno a 2.0 bares de presión, además de una presión de 1.5 bares de aire y 1.5 bares de hidrógeno. Las temperaturas del detector y del inyector se mantuvieron constantes a 270 ºC, mientras que la del horno varió a lo largo del análisis, partiendo de una temperatura inicial de 190 ºC, para pasar a una rampa de 5 ºC/min, con la que se alcanzaron los 250 ºC, y terminar en régimen isotermo hasta el final del análisis. Todo el proceso supuso un tiempo total de 12 minutos. Los AG fueron identificados por comparación de sus tiempos de retención con los de los patrones inyectados en las mismas condiciones. La cuantificación se llevó a cabo mediante el cálculo del porcentaje relativo de cada FAME respecto al total.

3.3 Caracterización de la composición proteica en las lipoproteínas ricas en triglicéridos

3.3.1 Cuantificación del contenido de apolipoproteína B total en TRL

La cantidad de apo B total se determinó mediante inmunoturbidimetría. El kit utilizado (BioSystems, Barcelona, España) permite que la apo B presente en la muestra precipite en presencia de los anticuerpos de cabra específicos que contiene. La dispersión de la luz generada por los complejos antígeno-anticuerpo es proporcional a la concentración de apo B y puede ser cuantificada por turbidimetría. Las medidas de turbidez se tomaron a 340 nm con un espectrofotómetro Thermo Scientific Multiskan Spectrum (Thermo Scientific, Massachusetts, EEUU). Las condiciones del ensayo fueron las indicadas por el fabricante, a excepción de la curva de calibrado con la que calcular la concentración de apo B, la cual se elaboró a partir del patrón apo B, con cinco puntos cuyas concentraciones estaban comprendidas entre 0- 1.278 μg/μl.

3.3.2 Determinación del contenido proteico de las TRL

La concentración de proteína total en la fracción de TRL se determinó mediante el ensayo colorimétrico descrito por Bradford [413], utilizando el reactivo Bradford 5x (SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemania). El método de Bradford se basa en el cambio que se produce en el espectro de color del reactivo Comassie Brilliant Blue G-250 al unirse con proteínas y que resulta en un cambio de su absorbancia máxima, pasando de 465 nm a 595 nm.

El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos y los valores de absorbancia se registraron en un lector de placas de Thermo Scientific Multiskan Spectrum (Thermo Scientific, Massachusetts, EEUU), a 595 nm tras 15 segundos de agitación. Para el ensayo, se diluyeron 20 µl de TRL hasta la mitad de su concentración (1:2), por lo que se añadieron 20 µl de una solución de NaCl al 0.9% (m/v). La recta de calibrado se elaboró con albúmina de suero bovino (BSA) a distintas concentraciones (200-700 µg/ml) en NaCl al 0.9% (m/v). En cada pocillo se dispusieron 10 µl de muestra y 200 µl de reactivo de Bradford. Todas las placas incluyeron una recta de calibrado y un blanco, realizado con NaCl al 0.9% (m/v). Por último, la reacción se dejó reposar en oscuridad durante 15 minutos antes de medir su absorbancia a 595 nm en el lector de placas.

4. ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LAS LIPOPROTEINAS RICAS EN TRIGLICÉRIDOS POSTPRANDIALES EN LA FORMACIÓN DE CÉLULAS ESPUMOSAS

na vez la composición de las TRL ha sido caracterizada, procedemos a estudiar in vitro la capacidad del componente lipídico de las TRL para modular la captación de las partículas por los macrófagos a través de su interacción con los receptores celulares de superficie. De esa manera, se evaluará su efecto en el proceso de formación de células espumosas por la acumulación de lípidos intracelularmente. La figura 13 representa el proceso experimental que se ha seguido en esta parte del estudio.

Figura 13. Diseño del proceso experimental seguido en el estudio de la influencia de las TRL postprandiales sobre el proceso de incorporación en macrófagos y la posterior formación de células espumosas. TRL Estudio de acumulación lipídica Tinción de lípidos intracelulares Caracterización de los lípidos intracelulares

1. Extracción de lípidos totales 2. Separación: FL y TG 3. Metilación de ácidos grasos 4. Perfil cromatográfico de ácidos grasos intracelulares

Nivel de expresión de receptores celulares 1. Extracción mRNA 2. RT-qPCR Monocitos THP-1 Macrófagos PMA 48 h Células espumosas Sonicar