2.3 When Performing Computer Music
2.3.2 Interactive Electronics
La identificación de los componentes de las muestras analizadas, se realizó por tres métodos, i) mediante comparación directa del espectro de absorción UV-Visible de cada pico con los estándares auténticos de la biblioteca de espectros; ii) por interpretación espectral de
los máximos de absorción y comparación con espectros reportados en bibliografía y iii) por tiempo de retención. Los cromatogramas obtenidos se analizaron en 3 longitudes de onda seleccionadas de acuerdo al tipo de compuestos de interés, 280 nm para ácidos fenólicos, 335 para flavonas y 380 para flavonoles.
2.2.5 Análisis Estadístico
La modificación del extracto por medio de cromatografía aniónica se llevó a cabo por triplicado en columnas separadas. El diseño experimental para la evaluación de la copigmentación fue generado utilizando cinco relaciones molares copigmento/pigmento (0, 25, 50, 75 y 100) y tres tipos de extracto de tomillo (Crudo WA30 y PA308). Las diferencias en la concentración de cada compuesto específico se calcularon usando los datos recolectados para cada longitud de onda. El análisis estadístico de la información generada se llevó a cabo utilizando el paquete estadístico JMP versión 5.0 (SAS Institute Inc. Cary, NC., EUA.) mediante el análisis de varianza (ANOVA), y la separación de medias se llevó a cabo utilizando la prueba de LSD (p<0.05). Además se evaluaron las correlaciones de Pearson entre las concentraciones de cada compuesto identificado en los extractos y las variables de respuesta de cambio hipercrómico, cambio batocrómico y actividad enzimática. Todos los tratamientos y análisis se llevaron a cabo por triplicado
2.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Como resultado del tratamiento del extracto de tomillo con las dos resinas aniónicas, se obtuvieron dos nuevos extractos (WA30 y PA308), los cuales se sometieron a una caracterización espectrofotométrica en el primer estudio de este proyecto para determinar el efecto de dicho tratamiento sobre la composición fenólica de los extractos. Una vez evaluado el efecto de las resinas aniónicas sobre los perfiles fenólicos los tres extractos fueron sometidos a pruebas en un segundo estudio, para determinar su capacidad de copigmentar jugo de fresa e incrementar la estabilidad de las antocianinas del mismo. Por último, con la intención de elucidar los cambios en la composición química de los extractos causados por el tratamiento con resinas aniónicas, se llevó a cabo un tercer estudio, en el cual se llevó a cabo un análisis detallado por HPLC-PDA para la identificación y cuantificación de los principales componentes de los extractos. Esto último con el objetivo de explicar las diferencias encontradas en sus propiedades de copigmentación y capacidad de servir como sustratos de PPO.
Estudio 1. Obtención del extracto acuoso de tomillo y modificación al proceso comercial
De acuerdo con el procedimiento descrito en la patente No. 5,908,650, como resultado de la evaporación del metanol, se obtuvo un extracto de tomillo de alta viscosidad, debido al contenido de agua residual de las operaciones de lavado en el procedimiento de extracción en fase sólida con columnas de C18. Se obtuvieron un total de 100 mL del extracto crudo con un peso de 128.8 g de fuerte olor pungente y color café oscuro, que representa un 12.9 % en peso con respecto al material vegetal de partida. La materia prima de la que se partió se obtuvo a granel, lo cual introduce la dificultad de certificar su origen y conocer la variedad de Thymus vulgaris que se empleó, así como de las condiciones de crecimiento de la planta, las cuales se sabe, influencian el contenido de ciertos compuestos en la especie. Por esta razón se empleó un solo lote de especie, adquirida en un supermercado local, para la obtención del extracto para todo el estudio, y evitar así el efecto de la variabilidad de la materia prima. El primer análisis realizado al extracto, fue su contenido de fenólicos totales, resultando una concentración de 0.6464 M ± 1.88 expresados como equivalentes de ácido gálico (EAG). Una caracterización parcial de la distribución de compuestos fenólicos en el extracto de tomillo se realizó mediante el método de Glories (Mazza, et al. 1999), dando como resultado el perfil de compuestos reportado en la Tabla 2.2.
Tabla 2.2 Perfil de compuestos fenólicos del extracto acuoso de tomillo (Thymus vulgaris) de acuerdo con el método de Glories1.
Concentración (Molal)2
Fenólicos
Totales3 Flavonas4 Flavonoles5
Extracto de Tomillo
Crudo 1.296 ± 0.0216 0.526 ± 0.008 0.233 ± 0.004
1Reportado por Mazza, et al. (1999). 2Concentración expresada en moles de equivalentes por kilogramo de extracto
obtenido. 3Expresados como equivalentes de ácido gálico. 4Expresados como equivalentes de ácido caféico. 5Expresados como equivalentes de quercetina. 6Error estándar calculado a partir de tres mediciones.
Para la determinación de fenólicos totales se empleó el método de Folin-Ciocalteau como un parámetro más exacto que el barrido espectral efectuado por el método de Glories, debido a que por tratarse de una mezcla rica en componentes, la concentración estimada a través de dicho método resulta más alta, esto es debido a la absorbancia proveniente de compuestos no fenólicos en ese rango de longitud de onda. Por lo anterior, este método solo puede ser empleado como una estimación primaria de la distribución de compuestos fenólicos en una muestra. El método proporcionó información preliminar de la distribución de compuestos fenólicos en el extracto. Las concentraciones de los tres tipos de compuestos resultan ser mayores que las estimadas por Del Follo (2003) para tomillo, en las que se reportó una concentración de fenólicos totales de 0.835 M, 0.288 M para flavonas y 0.142 M para flavonoles. Esta variación puede deberse a diferencias en el método de extracción de los compuestos fenólicos (temperatura, tiempo, agitación, etc) así como a la variabilidad de la materia prima empleada.
Modificación al proceso comercial de obtención de extractos de tomillo
Mediante el uso de la patente comercial de Lenoble (1999), se obtienen industrialmente extractos con las características descritas anteriormente para el tomillo, sin embargo uno de los objetivos de este estudio, fue ir mas allá y lograr un refinamiento mayor del contenido de compuestos fenólicos en dicho extracto mediante una modificación ó incorporación de pasos adicionales al procedimiento descrito en la patente con el propósito de superar limitaciones técnicas para la aplicación industrial de este tipo de aditivos.
El extracto original de tomillo (extracto crudo) fue pasado a través de una columna empacada con una resina aniónica débil, obteniéndose una solución (extracto WA30) con un contenido de fenólicos totales menor. De la misma forma, el contenido de fenólicos totales del extracto crudo disminuyó al ser tratado con la resina aniónica fuerte PA308 (en adelante extracto PA308). Los resultados se muestran en la Tabla 2.3.
Tabla 2.3 Contenido de fenólicos totales en extractos de tomillo crudo y modificado por cromatografía aniónica.
Extracto de Tomillo 1
Fenólicos Totales
(Molal)2 Error Estándar CRUDO 0.81153 ± 0,0061
WA30 0.6144 ± 0,0074 PA308 0.6992 ± 0,0010
1
CRUDO= sin tratamiento con resina aniónica, WA30= extracto tratado con resina aniónica débil, PA308= extracto tratado con resina aniónica fuerte. 2Expresados en moles de fenólicos totales como equivalentes de ácido gálico por
kg de tomillo3Promedio calculado a partir de tres determinaciones.
El empleo de resinas aniónicas para el fraccionamiento de extractos fenólicos para aplicaciones en alimentos no ha sido reportado antes en un proceso comercial. Sin embargo, había sido reportado con anterioridad por Guillén et al (1997) como una etapa de preparación analítica de muestra. Los autores emplearon dichas resinas para el fraccionamiento de fenólicos cargados y neutros en vino blanco como una etapa previa a su análisis por HPLC. Uno de los factores clave para el fraccionamiento empleando este tipo de resinas de intercambio, es la forma iónica de las especies de interés, en este caso los polifenoles ionizables del extracto de tomillo. La activación previa de las resinas de intercambio, asegura que la especie química del soporte se encuentre en la forma deseada, en este caso, se empleó un buffer de fosfatos con un pH de 6.5 y fuerza iónica (I) de 0.05 para asegurar que las aminas terciarias y cuaternarias de las resinas aniónicas se encontraran cargadas positivamente. De la misma manera, el extracto de tomillo crudo preparado como solución base para el fraccionamiento fue ajustado a pH de 6.5, con el fin de tener las formas disociadas de los ácidos fenólicos e hidroxicinámicos, los cuales tienen rangos de pKa de 3 a 5 (García-Conesa, 1999).
Como se mencionó anteriormente, el empleo de las resinas aniónicas para el fraccionamiento de los extractos de tomillo tuvo un efecto directo en la concentración de fenólicos totales (como EAG), disminuyendo la concentración de éstos en un 24.3 % para el caso de la resina débil WA30 y un 13.8 % para el caso de la resina fuerte PA308. El análisis posterior de cada uno de estos extractos por HPLC-PDA permitió obtener un perfil de compuestos fenólicos mas detallado, como se describirá en secciones posteriores. Esta disminución en el contenido de fenólicos totales influyó en primera instancia en el cálculo de las relaciones molares empleadas para los sistemas de copigmentación. La concentración molar de compuestos fenólicos totales del extracto de tomillo se empleó como base para el cálculo del volumen de copigmento necesario para alcanzar las relaciones copigmento/pigmento establecidas para este estudio, y debido a esta disminución, fue
necesario incrementar los volúmenes de copigmento necesarios para alcanzar la concentración de fenólicos requerida (Anexo 2).
Evaluación de la capacidad de los extractos de tomillo de servir como sustratos de PPO
Se ha observado anteriormente que la adición de extractos de tomillo disminuye la degradación de antocianinas y vitamina C en jugos procesados por altas presiones con alta actividad residual de polifenoloxidasa, debido a sus propiedades de copigmentación y propiedades antioxidantes (Del Follo, 2003). Sin embargo, la actividad enzimática residual sigue siendo responsable de una buena parte de la excesiva degradación que sufren las antocianinas copigmentadas durante el procesado y almacenamiento, y esto es debido a que algunos compuestos fenólicos presentes en el extracto crudo de tomillo actúan como sustratos enzimáticos de la polifenoloxidasa. Debido a esta limitante, un parámetro importante medido para cada uno de los copigmentos modificados en el presente estudio, fue su actividad frente a enzimas como la polifenoloxidasa (E.C. 1.14.18.1) con en fin de evaluar si el tratamiento del extracto de tomillo con resinas aniónicas tuvo efecto sobre la capacidad del mismo de servir como sustrato de la polifenoloxidasa. Para el ensayo enzimático se emplearon sistemas modelo de 3 mL, empleando PPO comercial en solución reguladora de pH 6.5 y un volumen fijo de solución de copigmento crudo y tratado con resinas aniónicas, estos sistemas de prueba se mantuvieron siempre a una temperatura de 30ºC. En la Figura 2.2 se muestra gráficamente la variación de la absorbancia en la solución con respecto al tiempo, de la cual, tomando la sección lineal, se desprende el valor de la pendiente para cada extracto, la cual expresa el cambio en la absorbancia con respecto al tiempo (∆A/∆t) en seg-1. Las pendientes de estas gráficas fueron transformadas en velocidades iniciales de formación de producto considerando la formación de o-quinonas y empleando su absortividad molar (ε= 5x103 M-1cm-1) reportada para soluciones reguladoras de fosfato (Stauffer, 1989) (Tabla 2.4).
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 10 25 40 55 70 85 100 115 130 145 160 175 190 205 220 235 250 265 280 295 310 Tiempo (seg) Absorbancia @ 420nm 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Absorbancia (CAT) @ 420nm
Tabla 2.4 Velocidades iniciales de formación de producto por la acción enzimática de polifenoloxidasa sobre extractos de tomillo y catequina.
Extracto de Tomillo1 Concentración Molar de Fenólicos Totales2 Velocidad inicial de formación de producto en µmol/min3 Error Std. de las velocidades5 Crudo 0.0954 0.1505 b4 ± 0.0031 WA30 0.0574 0.1706 b ± 0.0042 PA308 0.0614 0.0406 c ± 0.0017 Catequina (CAT) 0.0444 0.5676 a ± 0.0248
1Muestras tomadas a partir de los extractos de tomillo crudo y modificado con resinas aniónicas para copigmentación. 2Expresados como equivalentes de ácido gálico (EAG) en los extractos de prueba 3Expresada como µmol/minuto, y
obtenido a partir de la pendiente de la gráfica de absorbancia contra tiempo, considerando la absortividad molar (ε) de las quinonas en regulador de fosfatos como 5x103 M-1cm-1 (µmol/min) y un volumen de ensayo de 3 mL. 4Los valores
con letras diferentes entre una misma columna indican que son significativamente diferentes (LSD test, P<0.05).
5Obtenido a partir del promedio de tres determinaciones.
Figura 2.2 Actividad enzimática de sistemas modelo formulados con extractos de tomillo con polifenoloxidasa (300U/mL) y catequina 5mM @420 nm, 30ºC, pH 6.5.
1Los datos de catequina están graficados en eje secundario del lado derecho 2Los valores con letras diferentes entre
líneas de tendencia indican que poseen pendientes significativamente diferentes (LSD test, P<0.05). 3 [Fenólicos
Totales]=0.0271M en equivalentes de ácido gálico. 4[Fenólicos Totales]=0.0205 M en equivalentes de ácido gálico. 5[Fenólicos Totales]=0.0233 M en equivalentes de ácido gálico.
Catequina (CAT)1 Extracto crudo3 Extracto WA304 Extracto PA3085 Líneas de tendencia c b b2 a
El análisis de las velocidades de formación de producto (método de las velocidades iniciales) utilizando los diferentes extractos de tomillo como sustratos mostró que no existe diferencia significativa entre el extracto crudo y aquel tratado con resina aniónica débil WA30, contrario a lo que sucede con el extracto tratado con la resina aniónica fuerte, la cual presenta una disminución del 73 % en la actividad de la enzima (Tabla 2.4). Los valores de velocidad de formación de producto altos sugieren que la enzima dispone de mayor cantidad de sustrato, o que dispone de los cofactores necesarios para llevar a cabo su actividad enzimática. Los resultados obtenidos indican que la resina aniónica fuerte podría estar removiendo compuestos que son sustratos identificados de PPO, como catequina, epicatequina, ácido caféico, ácido p- cumárico, ácido gálico y otros (Stauffer, 1999). Otra posible explicación a este comportamiento sería que la remoción de compuestos activadores de la enzima que pudieran haber quedado retenidos en la resina aniónica. Con el propósito de ofrecer una explicación a lo observado se llevó a cabo la caracterización detallada de la composición fenólica de los extractos, resultados que se discutirán en una sección posterior.
Estudio 2. Evaluación de la capacidad de copigmentación de los extractos fenólicos de tomillo en jugo de fresa
Una vez efectuados los tratamientos del extracto de tomillo con resinas aniónicas, y llevados a cabo los ensayos para probar su capacidad para funcionar como sustratos de PPO (Estudio 1), fue necesario determinar que dichos extractos, aun conservaban su capacidad para ser empleados como copigmentos e incrementar la estabilidad de las antocianinas presentes en el jugo de fresa. El contenido de antocianinas monoméricas en las fresas empleadas para este estudio, determinado por el método de pH diferencial, fue de 16 mg ±
0.12 por cada 100 g de fruta, expresados como pelargonidina-3-glucósido. Este contenido de antocianinas en las fresas empleadas para producir el jugo, se encuentra dentro del rango de 14.8-41.8 mg/100 g reportado por Wrolstad et al. (1970) para 18 variedades de fresas. La clarificación del jugo con enzimas pectinasas eliminó el material suspendido (Figura 2.3), así como la pectina en disolución evitando introducir errores en las determinaciones espectrofotométricas por la turbidez del sistema, además de ser una práctica común en la producción industrial de jugos de frutas para evitar la formación de geles que dificultan su fluidez así como para obtener jugos translúcidos.
Adicionalmente se realizó un análisis de las antocianinas específicas presentes en el jugo de fresa por cromatografía de líquidos de alta resolución y mediante el uso del detector PDA se estableció la identidad de cada una de las especies identificadas (Figura 2.4). García- Viguera y otros (1996) reportaron que el contenido de antocianinas en fresas, consiste primordialmente de pelargonidina-3-glucósido, así como pequeñas cantidades de cianidina-3- glucósido y pelargonidina-3-rutinósido. Otros autores han reportado análisis de las
Figura 2.3 Cambio en la apariencia del jugo de fresa después de la clarificación. (A) jugo clarificado con pectinasas,15 minutos a 45ºC, (B) jugo sin clarificar.
A B 520 nm 1 2 3 1 2 3
Figura 2.4 Cromatograma HPLC-PDA de antocianinas presentes en jugo de fresa (Fragaria anannassa L.) a 520 nm. El espectro UV-Visible de cada pico mostrado en la parte superior del cromatograma, confirma su identidad química. Identificación de picos: (1) cianidina-3- glucósido; (2) pelargonidina-3-glucósido; (3) probable pelargonidina-3-rutinósido.
Absorba ncia Minutos 10.4 % 72.3 % 17.3 %
antocianinas presentes en jugo de fresa, y coinciden en que mas del 70 % de éstas corresponden a pelargonidina-3-glucósido y pequeñas cantidades de cianidina-3-glucósido, además de otros pigmentos derivados de la pelargonidina (Bakker, 1992; Sondheimer y Kertesz, 1956; Garzón y Wrolstad, 2002). El aislamiento y caracterización de las antocianinas del jugo de fresa empleado en este estudio dio como resultado que el 72.3 % de las antocianinas totales del jugo de fresa corresponden a pelargonidina-3-glucósido, el 10.4 % corresponden a cianidina-3-glucósido, mientras que el 17.3 % se trata de otro glicósido de pelargonidina, posiblemente rutinósido como lo reportaron García-Viguera y otros (1996).
Cambios espectrales en jugos copigmentados con extractos de tomillo
De acuerdo con estudios previos sobre la estabilidad de antocianinas copigmentadas con extractos fenólicos realizados por Del Follo (2003) y Covarrubias (2001) se formularon relaciones molares de 0 a 100 en la copigmentación llevada a cabo con jugo de fresa. Con base en la concentración de antocianinas del jugo de fresa empleado se calcularon los volúmenes de copigmento que mantuvieran dichas relaciones. Los estudios de Dimitri - Markovi et al. (2000) demostraron el efecto de la variación de la relación molar copigmento/pigmento sobre las propiedades espectrales de malvidina-3,5-diglucósido copigmentada con ácidos caféico y ferúlico, empleando como parámetros de medición la magnitud de los cambios hipercrómicos y batocrómicos en dichos sistemas. Los cambios hipercrómicos, son comúnmente expresados como el incremento porcentual en la absorbancia a la longitud de onda de máxima, mientras que los cambios batocrómicos se expresan en función del número de nanómetros que se desplaza dicha longitud de onda máxima producto de la adición de copigmentos. Estos cambios hipercrómicos y batocrómicos, se emplearon como variables de respuesta para determinar la capacidad de los extractos de tomillo modificados de servir como copigmentos. Los resultados de dichas determinaciones se muestran en la Tabla 2.5. En el caso de los cambios batocrómicos que tiene lugar en el jugo de fresa, se observa claramente que la adición de copigmento al jugo de fresa provoca cambios batocrómicos máximos en el nivel de 75, después del cual en el nivel de 100 no existe diferencia significativa. Una visualización gráfica de estos resultados puede ser apreciada en el Anexo 3. Este tipo de comportamiento de aparente saturación ha sido reportado por muchos autores como Dimitri -Markovi (2000); Ansen et al. (1972); Davies y Mazza (1993); Baranac et al. (1996); Covarrubias (2001); Del Follo (2003). Para el caso de los cambios hipercrómicos, el comportamiento es diferente; la magnitud del cambio porcentual presentó un máximo de saturación en el nivel 50 para el extracto crudo, en 75 para el extracto WA30 y en 100 para el extracto PA308. Independientemente de la relación molar en la que se observa la saturación, es en este último tratamiento con el extracto PA308 donde se observó un incremento
significativamente mayor en la absorbancia, lo que es altamente deseable debido a que indica que el extracto tiene mejor capacidad de copigmentación y potencialmente mayor capacidad estabilizante del pigmento.
Tabla 2.5 Efecto de la adición de extractos fenólicos de tomillo sobre las propiedades espectrales del jugo de fresa (Fragaria ananassa).
RELACIÓN MOLAR COPIGMENTO/PIGMENTO1 Extracto de Tomillo 0 25 50 75 100 Crudo 0,0 C2 8,0 B a2 13,0 A a 13,3 A b 14,0 A b WA30 0,0 D 8,0 C a 11,3 B a 13,7 A ab 12,7 AB b Cambio Batocromico3 PA308 0,0 D 9,3 C a 12,0 B a 15,3 A a 16,7 A a Crudo 0,0 C 47,0 A ab 50,2 A b 30,4 B c 33,6 B b WA30 0,0 C 32,5 B b 48,8 AB b 53,7 A b 40,2 AB b Cambio Hipercrómico4 PA308 0,0 E 56,8 D a 73,0 C a 98,5 B a 116,8 A a
1Definido como la relación molar de la concentración de copigmento expresado en equivalentes de ácido gálico entre la
concentración molar de antocianinas en el jugo de fresa expresada como equivalentes de pelargonidina-3-