Interior orientations

PLAGUICIDAS TETRADIFÓN Y PROPANIL EN D. magna.

3.5.1. Cálculo de la concentración óptima de alga.

Para determinar la concentración óptima de alga (Nannochloris oculata) que se debía utilizar en el estudio crónico, se realizó un estudio preliminar utilizando dos concentraciones de alga que debían servir como alimento a D. magna, asegurándonos así de que la concentración de alga presente en el medio era la más adecuada para llevar a cabo el ensayo. Esto es importante ya que si existe un exceso de alga en el medio, esta puede adherirse a los apéndices filtradores de los dáfnidos impidiéndoles la correcta filtración e ingestión del alimento, por otra parte si el alimento es escaso, el déficit nutricional debilita a los dáfnidos.

Las concentraciones seleccionadas para determinar esta concentración óptima de alga fueron 5x105 y 5x106 cél/ml, por ser las más recomendadas en la bibliografía (Allen y cols., 1995; Taylor y cols., 1998). Para ello, se centrifugó el alga a 3500 r.p.m. en una centrifuga KUBOTA con rotor de brazo libre, durante 10 minutos. Una vez centrifugada se eliminó el sobrenadante y se resuspendió en agua el precipitado donde se encontraban las células de alga.

Tomando una pequeña cantidad de esta suspensión se realizó una dilución de este concentrado de algas a fin de reducir el número de células y hacer más sencillo su recuento con una cámara cuentaglóbulos tipo Bürker. Realizado el recuento, se calculó la concentración de células presente en la suspensión y la cantidad de alga que se debía incorporar al medio para que la concentración en el mismo fuera la deseada.

Para cada concentración de alga se llevaron a cabo tres replicas del estudio en las que se utilizaron neonatos de D. magna (< 24h), estos neonatos procedieron del cultivo original que se mantiene en el laboratorio y fueron ubicados individualmente en frascos de vidrio de 60 ml de capacidad. Diariamente se renovó el medio de los dáfnidos inoculando la concentración apropiada de alga y se tomó nota de los neonatos nacidos entre las 24 horas que transcurren de un cambio a otro. Después de 15 días, se determinó la tasa intrínseca de crecimiento natural (r), siendo un parámetro que expresa el crecimiento potencial de una población en un ambiente dado, para cada una de las concentraciones de alimento ensayadas.

La concentración de alimento óptima fue aquella que presentó una tasa intrínseca de crecimiento natural mayor. En nuestro caso esa concentración fue la de 5x105 cél/ml.

Material y Métodos

3.5.2. Toxicidad crónica en D. magna.

Basándose en los resultados de los ensayos de toxicidad aguda previamente realizados por Ferrando y cols. (1996) en los que como ya se comentó anteriormente se calculó la CE50 del acaricida Tetradifón, se eligieron 4 concentraciones subletales de Tetradifón: 0.10, 0.18, 0.22 y 0.44 mg/l. Del mismo modo con los datos obtenidos del ensayo de toxicidad aguda del Propanil se eligieron también 4 concentraciones subletales que fueron: 0.07, 0.10, 0.21, y 0.55 mg/l.

En ambos casos, una vez pesado el tóxico en una balanza de precisión, se diluyó en acetona el acaricida Tetradifón y en agua el herbicida Propanil, ya que éste no requiere la utilización de disolventes orgánicos para su disolución; después, se preparó una solución stock para cada plaguicida de la que se tomó la cantidad necesaria para obtener las diferentes concentraciones a ensayar. El stock empleado fue de 10 mg por litro de agua, en ambos casos, realizándose las diluciones en matraces aforados de vidrio de 1 litro de capacidad. Además, se utilizó un control exento de plaguicida pero con acetona (22 µl/l) en el caso del Tetradifón, y un control blanco (sólo agua). A los matraces aforados que contenían las diluciones definitivas se les incorporó la cantidad de alga necesaria para la alimentación de los animales, 5x105 cél/ml.

Cada experimento constó de cinco replicas formadas cada una de ellas por tres animales (por lo tanto 15 replicas), dispuestos en frascos individuales de 60 ml de capacidad, rellenándose sólo con 50 ml de la dilución deseada.

Cada individuo fue introducido en uno de los frascos mediante el uso de una pipeta Pasteur de plástico. Durante los primeros días del ensayo se añadió alcohol cetílico al medio (en forma de lentejas), que como se ha comentado rompe la tensión superficial del agua e impide que los neonatos queden retenidos facilitando que se sumerjan completamente en el medio.

Diariamente se renovó el medio permitiendo así mantener la concentración de plaguicida constante. Los animales fueron transferidos a este medio fresco y se contaron los descendientes y los dáfnidos que habían muerto. En todo momento se evitó perturbar a los animales en el proceso de transferencia de un medio a otro.

Para cada uno de los tratamientos (con ambos plaguicidas) se realizó un ensayo crónico de 21 días de duración, al igual que para el control y el control con disolvente en el caso del acaricida Tetradifón.

Material y Métodos

Durante los 21 días que duraron los ensayos de toxicidad se evaluaron parámetros individuales como: el crecimiento, la supervivencia y la reproducción. También se evaluó la tasa intrínseca de incremento natural (r), por ser un parámetro poblacional muy recomendado como parámetro demográfico en estudios toxicológicos. Van Leeuwen y cols. (1985) comprobaron que existía una correlación del 99% entre el valor obtenido por (r) a los 21 días de vida de D. magna y el valor correspondiente al mismo parámetro calculado para todo el ciclo de vida. Por ello, se aceptó que el test de 21 días era apropiado para calcular la tasa intrínseca de crecimiento natural para una población de D. magna (Daniels y Allan, 1981; Day y Kaushik, 1987b; Stark y Wennergren, 1995).

El crecimiento se evalúa realizando mediciones del caparazón (cm) del animal desde la parte anterior del rostro hasta la base de la espina caudal (Roche, 1998; Sosak- Swiderska y cols., 1998; Barry, 1999; Muyssen y cols., 2002). Esta medición se llevó a cabo incorporando un micrómetro a una lupa binocular, midiéndose sólo aquellos individuos que sobrevivieron los 21 días que duró el ensayo.

La supervivencia de D. magna se correspondió con el número medio de días que el animal ha sobrevivido desde el inicio del ensayo, fue evaluada diariamente.

Longitud

Material y Métodos

Dentro de los parámetros reproductivos se estudiaron:

El tiempo a la primera puesta, o tiempo medio transcurrido desde el inicio del experimento hasta la primera reproducción de los animales.

Tamaño medio de la camada, número medio de neonatos que cada hembra pone en cada camada.

Número de neonatos por hembra, corresponde al numero medio de neonatos totales nacidos por cada hembra, durante los 21 días de ensayo.

Número de camadas, es el número medio de camadas producidas por cada hembra durante el ensayo.

La tasa intrínseca de crecimiento natural (r), ha sido calculada utilizando la fórmula de Lotka (1913):

1

.

.

=

∑

m

e

l

Donde x es el intervalo de tiempo observado; lx es la probabilidad de sobrevivir a la edad x; mx el número de neonatos por hembra a la edad x, nacidos durante el intervalo (x, x+1); y r la tasa intrínseca de crecimiento natural calculada a los 21 días.

Basándose en los valores obtenidos para la tasa intrínseca de crecimiento natural (r) se estimó el valor de la concentración máxima aceptable (MATC) como la media geométrica de la mayor concentración de plaguicida que no produjo efectos significativos en la r (NOEC) y la menor concentración de tóxico que produjo efectos significativos en el mismo parámetro (LOEC) (Buhl y cols., 1993; Staples y cols., 2000; Chen y Lin, 2001; Eason y O’Halloran 2002).

Por otra parte, se determinaron los valores de la CE50 para aquellos parámetros en los que fue posible; para ello se utilizó la ecuación de una recta de regresión y=a+bx, calculada sobre la base de los valores obtenidos para cada uno de los parámetros seleccionados, siendo “x” la concentración de tóxico ensayada e “y” la reducción del 50% del parámetro considerado.

Los parámetros individuales evaluados (reproducción, supervivencia y crecimiento), así como la tasa intrínseca de crecimiento natural (r), se determinaron para cada tratamiento.

Material y Métodos