Internal Fixation Point Actuators

BBL Crystal, los aislados fueron identificados de la siguiente manera: 5 como Enterobacter sp., 6 como B. cepacia, 4 como S. maltophilia, 1 como K. pneumoniae, 1 como K. oxytoca, 1 como Chryseobacterium sp., y 1 como S. fonticula. No se observó correspondencia al relacionar la identificación bioquímica con la caracterización molecular por PCR. En la extracción de ADN se eligió iniciar el proceso con cultivos líquidos en caldo LB incubados a 37 º C por 24 horas, ya que este medio proporcionó las condiciones y nutrientes necesarios para el mantenimiento y conservación de las cepas y fue el medio inicial que se empleó para preparar las cepas para el aislamiento de ADN.

El aislamiento de ADN usando el UltraClean® microbial DNA isolation kit proporcionó un ADN de buena calidad, sin

degradación que migró en el gel, como banda única de alto peso molecular; además de ser una técnica de fácil manejo y gran sensibilidad.

Los resultados de la PCR utilizando los cebadores GTG(5)-PCR y BOX-PCR mostraron amplificación para las 19 cepas aisladas (Figuras 1 y 2). Se comprobó la reproducibilidad realizando una segunda PCR y observándose patrones de bandas similares.

Figura 1. BOX-PCR

Descripción: Línea 1: Marcador de peso

molecular Hyperladder II; Líneas 2 a 18:

Aislados Diazot1, Diazot2, Diazot3, Diazot4 Diazot5, Diazot6, Diazot7, Diazot8, Diazot9,

Diazot10, Diazot11, Diazot12, Diazot13,

Diazot14, Diazot15, Diazot16, Diazot17,

Diazot18,

Figura 2. GTG(5)-PCR

Descripción: Línea 1: Marcador de peso

molecular Hyperladder II; Líneas 2 a 18:

Aislados Diazot1, Diazot2, Diazot3, Diazot4 Diazot5, Diazot6, Diazot7, Diazot8, Diazot9,

Diazot10, Diazot11, Diazot12, Diazot13,

Diazot14, Diazot15, Diazot16, Diazot17,

Los resultados de la caracterización mostraron claramente distintos patrones de amplificación para todas las cepas, con gran cantidad de bandas comunes entre algunos aislados.

En el análisis filogenético utilizando los cebadores BOX-PCR se observó que el índice de similaridad de los aislados nativos era mayor (0.18) (Figura 3) que el índice obtenido con el primer GTG(5)-PCR (0.10) (Figura 4), sin embargo se logró el agrupamiento de aislados presentando una similaridad del 100%.

Figura 3. Dendograma BOX-PCR

Descripción: El agrupamiento de los aislados con los cebadores BOX-PCR genero 4 clústers. Clúster I: los aislados Diazot1, Diazot2, Diazot3, Diazot5, Diazot13, Diazot14, Diazot16, Diazot17 y Diazot18. Clúster II: los aislados Diazot7, Diazot8, Diazot12 y Diazot15. Clúster III: los aislados Diazot4 y Diazot11. El clúster IV: los aislados Diazot6, Diazot9 y Diazot10.

En la caracterización molecular con GTG(5)- PCR y BOX-PCR de los 19 aislados se observa una alta variabilidad que no permite relacionar genéticamente todos los aislados. Sin embargo estos marcadores

moleculares también forman grupos idénticos entre los aislados. GTG(5)-PCR genera 4 clústers que presentan una similaridad de 0,1 entre sí, pero permiten el agrupamiento de todos los aislados del clústers I en dos grupos con 100% de similitud.

Figura 4. Dendrograma GTG (5-PCR

Descripción: El agrupamiento de los aislados

con los cebadores GTG (5-PCR genero 4

clusters. Clúster I: los aislados Diazot1, Diazot2, Diazot3, Diazot5, Diazot13, Diazot14, Diazot17, Diazot18 y Diazot19. El clúster II: los aislados Diazot6, Diazot7, Diazot8, Diazot10, Diazot12, Diazot15 y Diazot16. El clúster III: aislamiento Diazot4. El clúster IV: los aislados Diazot9 y Diazot11.

Mientras que el marcador BOX presenta un alto polimorfismo, mostrando mayor grado de variabilidad genética entre los aislados analizados.

Estudios similares de caracterización molecular realizados en diferentes grupos de bacterias fijadoras de nitrógeno de igual manera muestran una alta variabilidad a nivel intra e inter especifico.

Regalado et al., en el 2001, caracterizan 428 aislados de bacterias asociadas al arroz mediante BOX-PCR, obteniendo 151 tipos únicos de perfiles, que permitieron identificar que géneros eran predominantes: Enterobacter sp. (25%), Bacillus sp. (22%), y Pseudomonas sp. (14%).

En una revisión hecha por Ishii y Sadowsky [5], proponen que rep-PCR puede ser usada para examinar la diversidad genética de diversas bacterias fijadoras de nitrógeno, como Rhizobium sp., Bradyrhizobium sp. y Nitrobacter sp; además este marcador podría relacionar al microorganismo con el nivel de patogenicidad, como en el caso de Streptomyces sp.; también rep-PCR permite conocer diferencias especificas a nivel de especie y subespecie.

En otra investigación realizada por Elboutahiri et al. [6], comparan las técnicas rep-PCR y ERIC PCR con otras técnicas como ARDRA y RAPD en 20 cepas de Sinorhizobium meliloti y Rhizobium sullae, demostrando que rep-PCR y ERIC PCR son más eficientes en la genotipificación de estas dos especies.

Al analizar los agrupamientos con los dos marcadores se observa que en el resultado con BOX-PCR, 7 de 9 aislados del clúster I (Diazot1, Diazot2, Diazot3, Diazot13, Diazot14, Diazot17 y Diazot18), se encuentran agrupados en el clúster I del análisis con GTG(5)-PCR; ambos agrupamiento comparten un 65% de similitud, aproximadamente. De igual manera los aislados Diazot7, Diazot8, Diazot12 y Diazot15 agrupados en el clúster II con BOX-PCR, se encuentran agrupados en el clúster II con GTG(5)-PCR; y estos clústers coinciden en un 45% de similitud aproximadamente. También los aislados Diazot11, Diazot14 y Diazot9 comparten su agrupamiento en el análisis con los dos marcadores. Lo anterior, muestra que posiblemente, los dos marcadores están relacionando las mismas

características moleculares en los aislados y que podrían ser utilizados para la caracterización de diazótrofas y la determinación de variedades de acuerdo a determinadas características, como bioquímicas y nutricionales.

Al relacionar los resultados de la identificación bioquímica con la caracterización molecular no se observa correspondencia, donde grupos de aislados con perfiles genéticos 100% similares, son determinados mediante BLL crystal como especies diferentes. Esto debido probablemente a que los individuos de una misma especie no necesariamente van a tener los mismos atributos genéticos, bioquímicos y toxicológicos.

CONCLUSION

Finalmente, se puede concluir que las técnicas moleculares como BOX-PCR y GTG(5)-PCR permiten la caracterización e identificación de microorganismos con un alto grado de sensibilidad y especificidad.

REFERENCIAS

1 Baca, B., Soto, L., y Pardo, M. Fijación biológica de nitrógeno. Centro de Investigaciones Microbiológicas del ICUAP. 2000. 2 Mantilla-Paredes, A., Cardona.,

Venegas, P., Murcia. Distribución de bacterias potencialmente fijadoras de nitrógeno y su relación con parámetros fisicoquímicos en suelos con tres coberturas vegetales en el sur de la Amazonia colombiana. Bogotá, Colombia. 2009. vol57-4

3 De Vuyst, L., Camu, N., De Winter,

T., Vandemeulebroecke, K., Van de Perre, V., Vancanneyt, M., De Vos, P. & Cleenwerck, I. Validation

of the (GTG)5-rep-PCR

fingerprinting technique for rapid classification and identification of acetic acid bacteria, with a focus

fermented cocoa beans. Int J Food Microbiol. 2008. 125, 79–90.

4 KIm, S. R., Nonaka, L., Suzuki, S. Occurrence of tetracycline resistance genes 390 tet (M) and tet (S) in bacteria from marine aquaculture sites. FEMS Microbiology Letters. 2004. 391 237, 147-156.

5 Ishii, S. and Sadowsky, M. J. Applications of the rep-PCR DNA fingerprinting technique to study microbial diversity, ecology and evolution. Environmental Microbiology. 2009, 11: 733–740. 6 Elboutahiri, N., Thami-alami, I and

Udupa, S.M., Phenotypic and genetic diversity in Sinorhizobium meliloti and S. medicae from drought and salt affected regions of Morocco. BMC Microbiology. 2010.

EVALUACION DE UN SUPLEMENTO ALIMENTICIO A BASE DE Saccharomyces

cerevisiae Y Lactobacillus casei PARA LA ALIMENTACION DE MOJARRA ROJA

(Oreochromis sp) EN ETAPA DE ALEVINAJE Y PRECRIA

Díaz, Claudia1 Medina, Alexis2 Angarita, Linereth3 Casadiegos, Anny3 Botello, Jonathan3

1_{Directora Grupo de investigación CRISÁLIDA, Universidad de Santander-Cúcuta,} [email protected].

2

Asesor científico. Ing. de Producción Biotecnológica. 3

Estudiantes auxiliares-Programa de Bacteriología y Lab. Clínico UDES-Cúcuta. Resumen

El aumento en los costos de producción en el cultivo de mojarra roja (Oreochromis sp) se ve influenciado por la utilización de concentrados alimenticios a base de harina de pescado, elevando el costo en la cría y levante debido a los sobrecostos de transporte y almacenamiento, incrementando de forma directa el precio final al consumidor. Por consiguiente, el objetivo de esta investigación se centró en explorar otras alternativas para la alimentación de la mojarra roja mediante el suministro de un suplemento probiótico a base de proteína unicelular. Para esto se realizó la producción por medios fermentativos de los microorganismos probióticos y se formuló dicho suplemento, se determinó su composición bromatológica y luego se evaluó la ganancia de peso, supervivencia y talla de las especies en las etapas de alevinaje y precría durante 8 semanas respecto al tratamiento control. Los resultados mostraron que el mejor peso promedio y talla se alcanzó con el tratamiento T4,correspondiente a una dieta de 100% suplemento probiótico respeto a las demás dietas evaluadas, seguido por el tratamiento con 10% de suplemento(T3),quedando rezagado el tratamiento control(T0) correspondiente al alimento comercial. Igualmente, se logró reducir el tiempo entre la etapa de alevinaje a precría en 10 días (de 45 a 35 días), lo que se traduce en mayores ganancias para el piscicultor. Concluyendo así, que las especies de mojarra roja alimentadas con dietas suplementadas con probióticos y levaduras muestran mayor crecimiento, eficiencia alimenticia y menores tiempos de producción, siendo estos microorganismos, un aditivo apropiado para estimular el crecimiento en tilapia.

Palabras claves: Probióticos, mojarra, alevinaje, proteína unicelular, Saccharomyces cerevisiae

1. INTRODUCCIÓN

Actualmente se observa en los países en desarrollo una tendencia a la intensificación en la acuicultura lo cual implica aumento en la demanda de concentrados alimenticios, esta situación ha estimulado las

investigaciones de diversas alternativas en cuanto al origen de los nutrientes a fin de identificar proteínas con calidad nutricional adecuada que sustituyan a la proteína animal sin afectar el crecimiento de los peces. El ingrediente más usado en la alimentación de peces es la harina de

pescado, esta es la mejor fuente de energía concentrada para alimentar a los animales. Su valor nutricional es notablemente mayor que muchas otras proteínas animales o vegetales ya que proporciona una fuente concentrada de proteína de alta calidad y una grasa rica en ácidos grasos como omega-3, ácido decosahexaenoico (DHA) y ácido eicosapentanoico EPA indispensables para el rápido crecimiento de los animales. En 1993, la FAO (1) expresó que los alimentos utilizados en muchas dietas no son las específicas para peces, estableciendo como causa de tal situación dos factores esenciales, a saber: dificultades para adquirir el alimento requerido para peces, particularmente en regiones alejadas de las plantas productoras, así como el precio elevado del alimento para peces, que en muchos casos conlleva a que el productor opte por alimentos con menos proteína pero más baratos, percibiéndose como uno de los problemas la ausencia de oferta de alimentos específicos para mojarra roja con relación calidad/precio razonable. Situación que genera la necesidad de nuevas alternativas de alimentación para peces. La modificación del alimento a base de microorganismos probióticos en animales es relativamente nuevo, pero teniendo en cuenta los estudios realizados en esta área, se ha demostrado que los peces asimilan correctamente el alimento, al mismo tiempo que brinda efectos benéficos a la capacidad digestiva de los peces, así como en su habilidad para sobrellevar el contacto con cepas patógenas presentes en el agua.

El objetivo de este trabajo fue realizar un estudio comparativo entre dos tipos de alimentación, la tradicional a base de concentrado y otra a base de un suplemento alimenticio a partir de microorganismos probióticos para tilapia roja (Oreochromis sp), teniendo en cuenta variables elementales como la calidad del agua, condiciones del medio ambiente y

concentración del suplemento alimenticio, con el fin de determinar si la adición de este suplemento acelera el crecimiento de los peces en la etapas de alevinaje y precría.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Producción de suplemento

alimenticio a base de Saccharomyces

cerevisiae y Lactobacillus casei.

La producción de la proteína microbiana se realizo en los laboratorios de Microbiología de la Universidad de Santander (UDES) sede Cúcuta, teniendo como medio de producción lactosuero dulce modificado, utilizando biorreactores de acero inoxidable de capacidad 20L, los microorganismos fueron evaluados tanto en cultivo mixto como monocultivo, estableciéndose como tiempo de proceso 24 horas según los parámetros cinéticos arrojados en los montajes previamente realizados. Durante este tiempo se determinaron parámetros como concentración de microorganismos, velocidad específica de crecimiento, tiempos de duplicación, variación de pH y acidez titulable, entre otros. Pasado el tiempo de producción, se detuvo el proceso de fermentación sometiendo el medio de cultivo fermentado a temperaturas de 4°C (refrigeración) hasta el momento de su manipulación. Para el proceso de secado de la proteína unicelular se colocó el medio fermentado en bandejas de aluminio por 18 horas en un horno industrial con corriente de aire ascendente, a temperatura de 37+/- 2ºC, luego de esto se retiro la proteína y se molió para la elaboración del concentrado.

2.2 Recepción y distribución de los alevines.

Los bioensayos para determinar la respuesta de Oreochromis sp, a las diferentes dietas se realizaron en las instalaciones de la cooperativa de piscicultores Coopezca ubicada en el Municipio del Zulia. Se colocaron las

bolsas con los 250 alevines de 4 días de nacidos, en el estanque sin ser manipulados, permitiendo la climatización de los mismos, por un periodo de 15 minutos aproximadamente. Transcurrido este tiempo, se bañaron los alevines, sumergiéndolos por 5 segundos en una solución de 500 g/l de NaCl preparada con el agua del estanque, para luego distribuirlos en jaulas flotantes o hapas de 1,5 m de largo x 1,5 m de ancho y 1,2 m de profundidad, separados en 5 tratamientos, 4 de los cuales fueron alimentados con la proteína unicelular así T1 (5%),T2 (7,5%),T3 (10%) y T4 (100%),y el control negativo T0 (100%) alimento comercial. Se utilizó un diseño completamente aleatorio, con 5 tratamientos (50 individuos) distribuidos en tres repeticiones por tratamiento, con flujo continuo de agua. El alimento fue suministrado diariamente, los pellets fueron previamente molidos, pesados y entregados manualmente, tres veces por día en condiciones normales de flujo de agua al estanque.

2.3 Determinación de peso,

supervivencia y talla.

La evaluación se realizó por un período de 8 semanas. El peso total se determinó cada ocho días durante la etapa de alevinaje (primeros 45 días de iniciado el ensayo),luego de este periodo se procedió a evaluar la etapa de precría manteniendo la misma frecuencia de evaluación. Se tomó el registro diario de la mortalidad en cada tratamiento y se peso cada alevín utilizando una balanza digital. La talla fue determinada en la semana 7 de evaluación y los animales empleados fueron sacrificados y evaluados por medio de una escala graduada en cm, tomando como longitud total la medición desde el hocico hasta el extremo posterior de la aleta caudal. Los datos obtenidos en cada etapa fueron analizados mediante el software Statgraphics Centurion XV. Versión 15.2.06 para estimar los estadísticos de prueba.