El tracto gastrointestinal es un lugar altamente colonizado por microorganismos. La capacidad de formación de biofilms de una bacteria por lo tanto jugará un importante rol en el proceso de colonización. Se ha descrito que la cepa EcN es un excelente colonizador que puede competir con cepas comensales y establecerse en el tracto gastrointestinal (Leatham et al., 2009). Estudios in vitro han evidenciado que EcN es capaz de competir con cepas patógenas en su capacidad de formar biofilms sobre superficies abióticas. De ahí su utilización en el tratamiento de diarreas causadas por bacterias enteropatógenas (Hancock et al., 2010a). Debemos recordar que EcN expresa diferentes adhesinas relacionadas con los procesos de adhesión como son las fimbrias de tipo I, Ag 43, curli y celulosa (Hancock et al., 2010a).
De entre las serin proteasas de la familia SPATE, EspP (clase I) ha sido relacionada con la formación de biofilms (Tabla 1.2 apartado introducción). Con estos antecedentes, nos propusimos evaluar la capacidad de formación de biofilms de la cepa EcN y del mutante derivado EcNsat::cm. La finalidad de este estudio era evaluar si la deficiencia en la expresión y secreción de Sat podría modificar la capacidad de adhesión de la cepa probiótica sobre diferentes superficies. Para ello realizamos ensayos de formación de
biofilms sobre superficies abióticas y superficies bióticas. Para simular las condiciones de adhesión y colonización en el intestino estas superficies fueron recubiertas con mucina comercial Tipo II.
5.3.6.1 Formación de biofilms en superficies abióticas.
Para el estudio de la formación de biofilms sobre superficies abióticas se utilizaron placas de poliestireno (placas de 96 pocillos). Se analizó la capacidad de las cepas EcN y EcNsat::cm de adherirse a estas placas, bien sin tratar o con los pocillos recubiertos de mucina Tipo II. Las cepas fueron crecidas en medio LB y procesadas para la
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cuantificación del índice de formación específica de biopelícula o biofilm (FEB) según se detalla en el apartado de Métodos 4.10. Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 5.22A. No se observaron diferencias significativas entre ambas cepas en los índices de formación de biofilms. Ambas cepas son capaces de formar biopelículas sobre poliestireno. La formación del biofilm no se ve incrementada en presencia de mucina en ninguna de las cepas ensayadas. Estos resultados sugieren que la serin proteasa Sat no es determinante en los procesos de adhesión a superficies abióticas. 5.3.6.2 Formación de biofilms sobre superficies bióticas.
La capacidad de algunas cepas probióticas de inhibir la colonización por parte de patógenos se ha relacionado con su capacidad de adherirse al mucus y/o a las células epiteliales. Estas condiciones pueden simularse en modelos in vitro (Laparra and Sanz, 2009). Para ello utilizamos diferentes modelos: (i) células Caco-2 en cultivo, (ii) células Caco-2 recubiertas con mucina Tipo II y (iii) co-cultivos (90:10) de células Caco-2 y células HT29-MTX (línea de epitelio intestinal productora de mucinas). Se prepararon cultivos de estas líneas celulares en placas de 12 pocillos y se incubaron 21 días para su diferenciación. Estas células fueron incubadas durante 3 horas con suspensiones de la cepa probiótica wild type o con el mutante EcNsat::cm a una MOI de 100. Transcurrido este tiempo las bacterias no adheridas fueron retiradas y la monocapa de células epiteliales tripsinizada para la posterior recuperación y recuento de las bacterias adheridas (Método 4.10.2). Los resultados de este ensayo se presentan en la Figura 5.22B.
No se observaron diferencias significativas entre la cepa EcN y el mutante deficiente en Sat en ninguno de los modelos analizados. Ni la adición de mucina comercial (mucina Tipo II de Sigma) ni la secreción de mucina por las propias células HT29-MTX provocaron un incremento en la capacidad de adhesión de estas cepas. El origen y composición de estas mucinas son diferentes pero algunos componentes son comunes. La mucina comercial Tipo II (Sigma) derivada de estómago contiene las mucinas MUC5AC, MUC6, MUC1, MUC4, MUC12, MUC13 y MUC17. La línea HT29-MTX es una línea celular productora de mucina, obtenida a partir de la linea HT-29 mediante un tratamiento establecido con metotrexato. Los principales componentes de la mucina secretada por estas células son MUC5AC y MUC6 y en menor proporción MUC2 (Lesuffleur et al., 1993; Leteurtre et al., 2004). El hecho que la adición de mucina no mejore la formación de biofilms sobre células Caco-2 ha sido también descrito para otras cepas de E. coli (Laparra and Sanz, 2009).
En conjunto estos resultados indican que la serin proteasa Sat no está implicada en la formación de biofilms en modelos in vitro. Los factores de EcN implicados en la formación de estas biopelículas están presentes en ambas cepas, la tipo wild type y el mutante sat::cm, y la deficiencia en Sat no altera dicha capacidad.
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Figuras 5.22. Formación de biofilms por las cepas EcN y EcNsat::cm. A) Biofilms sobre superficies
abióticas. Las cepas indicadas fueron crecidas sin agitación durante 18 horas a 37ºC en placas de poliestireno (recubiertas o no con mucina Tipo II) que contenían medio LB. La capacidad de adhesión a estas superficies fue evaluada por tinción con cristal violeta. Los resultados, expresados en función del índice FEB, representan la media ± SE de tres experimentos. B) Biofilms sobre superficies bióticas. Se utilizaron células Caco-2 en cultivo (recubiertas o no con mucina Tipo II) y co-cultivos de células Caco- 2/HT29MTX. Estos cultivos fueron incubados con suspensiones de las cepas indicadas (MOI 100) durante en 3 horas. Los resultados, expresados como nº de bacterias (UFC) adheridas, corresponden a la media ±SE calculada a partir de triplicados de tres experimentos independientes.