Se denomina así a la cuantificación de una muestra que se realiza mediante la comparación con un “calibrador”. El “calibrador” es una muestra cuya cantidad, conocida o no, se asume como valor 0, de manera que los resultados de cuantificación se expresarán como la cantidad relativa a ese calibrador. Esta técnica se utiliza generalmente para la cuantificación de la expresión de genes, que se expresará como aumento o descenso de la expresión del gen en relación con la cantidad del gen en el calibrador.
51 Para llevar a cabo este tipo de cuantificación es necesario, además, un control endógeno, que consiste en un gen de expresión constante (ingles: housekeeping gene). Éste se conoce como normalizador. El normalizador sirve como control ya que debe amplificarse a partir de todas las muestras de estudio y puesto que su expresión no varía, cualquier variación de la cantidad de normalizador detectada mediante PCR se debe a errores de pipeteo, variaciones en la cantidad inicial de muestra, variaciones en la extracción, o incluso en la RT. Teniendo en cuenta estos datos, el normalizador sirve para estandarizar, de manera que podamos asegurar que una variación en la expresión del gen de interés sea en realidad una variación en la expresión y no un error de la técnica. Los genes más utilizados como normalizadores son rRNA 18S, GAPDH, β-Actina, TBP, HPRT, B-2microglobulina. A la hora de elegir el gen normalizador debe tenerse en cuenta el estudio para el que se va a utilizar, y comprobar que en las condiciones que se van a producir a lo largo del estudio, no se producen variaciones en su expresión (Huggett et al., 2005).
En definitiva, los resultados de la cuantificación relativa para un gen, se expresan como la cantidad relativa detectada respecto a la cantidad del mismo gen en la muestra calibrador, y todo ello estandarizado mediante la medición de un gen normalizador tanto en la muestra problema como en le calibrador.
I.3.2. CITOMETRÍA DE FLUJO PARA LA DETECCIÓN DE POBLACIONES CELULARES DEL SISTEMA INMUNE
Las células del sistema inmune presentes en sangre proporcionan gran cantidad de información sobre el tipo de RI que se desarrolla en respuesta a diferentes estímulos. Con el fin de evaluar la magnitud de la respuesta, las células que están siendo activadas y las vías moleculares que intervienen, es muy importante conocer los niveles basales de la población de células. Todos estos datos pueden obtenerse a través de la citometría de flujo.
I.3.2.1 PRINCIPIOS BÁSICOS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO
La citometría de flujo es una técnica objetiva, sensible y cuantitativa que permite el análisis rápido y simultáneo de varios parámetros en un gran número de células (Gane, 2002), por lo que se ha convertido en una herramienta importante para la hematología y la investigación inmunológica (Tarrant, 2005).
Para llevar a cabo esta técnica se parte de una solución de células que se hacen pasar a través de un haz de láser de una en una (Figura 14). Este paso de manera individual se consigue gracias al flujo laminar que se genera en el citómetro. Cuando el haz de luz incide sobre cada una de las células se obtienen datos sobre las características físicas de éstas ya que se produce una sombra proporcional al tamaño de la célula (dispersión hacia adelante), y además, la luz se desvía lateralmente, proporcionando información sobre su estructura
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(dispersión lateral). Estas características denominadas tamaño y complejidad, se utilizan para diferenciar poblaciones celulares (Kania, 2008).
Figura 14. Esquema del citómetro de flujo (Adaptado de http://www.biotechspain.com).
Además, basándose en el principio de unión antígeno-anticuerpo se pueden utilizar anticuerpos monoclonales conjugados con un fluorocromo para señalizar las células según sus proteínas de membrana. Esta unión específica del anticuerpo al antígeno se puede detectar mediante la fluorescencia emitida por la célula a su paso por el haz de láser (Tarrant, 2005). La capacidad de la técnica, permite teóricamente analizar hasta 11 parámetros (tamaño, complejidad y la señalización con hasta 9 fluorocromos).
I.3.2.2. APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO
La citometría de flujo es una herramienta utilizada en diferentes ámbitos tales como la biología molecular, la patología, la inmunología, la biología vegetal y la biología marina, entre otros. Una de las aplicaciones más utilizadas tanto en medicina humana como en veterinaria es el estudio de las diferentes poblaciones de la serie blanca. Para realizar este análisis, se representan los eventos (células) en un citograma de dispersión de acuerdo al tamaño y la complejidad de las células. De esta manera como se observa en la figura 15 se pueden diferenciar las poblaciones celulares: linfocitos, monocitos, neutrófilos eosinófilos y basófilos (que no dispersan la luz debido a la composición química) además de alguna población anormal de blastos y células. En forma de “ruido” aparecen los restos celulares de los hematíes, plaquetas y la suciedad.
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Figura 15. Citograma de dispersión donde se observa la separación de las diferentes poblaciones celulares.
I.3.3. TERMOGRAFÍA INFRARROJA COMO HERRAMIENTA PARA LA DETECCIÓN DE FIEBRE
La Termografía Infrarroja (TI) es una herramienta para la medición de la temperatura y, por tanto, también útil para la detección de fiebre.
I.3.3.1. PRINCIPIOS BÁSICOS DE LA TERMOGRAFÍA INFRARROJA
El movimiento mecánico de las moléculas produce energía en forma de calor, la cual es liberada a través de la superficie corporal en forma de radiación. La TI se fundamenta en el principio de que todos los cuerpos son capaces de emitir y reflejar radiación infrarroja y en que esta radiación es proporcional a la temperatura superficial corporal (Kastberger y Stachl, 2003). Con la TI, el calor es detectado en el espectro infrarrojo (Bitar et al., 2009) a través de una cámara termográfica que genera una imagen con una gama de colores correspondiente con el patrón de las diferentes temperaturas (Figura 16).
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I.3.3.2. APLICACIONES DE LA TERMOGRAFÍA INFRARROJA
En origen, la TI fue una herramienta utilizada en ingeniería y arquitectura, sobre todo a nivel industrial en la inspección de equipos eléctricos y sistemas de aislamiento térmico. Pero su utilización no está limitada a estos ámbitos. Desde 1950 la TI ha sido utilizada en medicina, siendo descrito su primer uso en este campo para la detección de aumento de temperatura en la piel en tumores de mama (Head et al., 1993; Jiang et al., 2005).
La capacidad de la TI para detectar personas con fiebre es considerada como una característica interesante que puede ser útil también en la medicina preventiva. Destaca como ejemplo su empleo durante la epidemia del síndrome respiratorio agudo severo (SRAS) de 2003 en aeropuertos mediante escáneres térmicos (PublicHealthAgencyofCanada, 2004).
A la hora de recopilar datos de temperatura para la detección de la fiebre el dispositivo ideal debe ser rápido y no invasivo (Ng et al., 2004) siendo éste un punto crucial cuando se trabaja con animales, los cuales pueden padecer estrés con el simple hecho de entrar en contacto con los seres humanos. En el campo de las ciencias veterinarias se debe tener en cuenta que el calentamiento de la superficie corporal depende de factores como el tegumento, ya que se producen grandes variaciones si hay plumas, pelo o púas respecto a la piel desnuda. En el ámbito veterinario, existen estudios relacionados con lesiones del aparato locomotor en caballos (Turner, 1991), detección de inflamaciones en los animales de zoológico, evaluación de la fertilidad de los huevos de aves (Melero M. et al., 2009), el estudio del patrón de aparición de ventanas térmicas en morsas (Rodríguez-Prieto, 2011) y la evaluación de fiebre en terneros infectados con el virus de la diarrea vírica bovina.