Los resultados generados en este trabajo evidenciaron varios aspectos desconocidos de la respuesta inmune a RV en humanos: i) la ausencia de LT CD4+ y CD8+ específicos de RV
secretores de IL-2, IL-10 e IL-17 en niños menores de 2 años, adicionalmente a la ausencia de IFN- e IL-13 reportada previamente y confirmada en este trabajo; ii) la ausencia de LT
CD4+ y CD8+ específicos de RV secretores de IL-17+ en adultos; iii) la existencia de LTCD4+ IFN-+/IL-2+ en voluntarios sanos; pero sólo en un 50% de ellos; iv) la presencia de subpoblaciones de LT CD4+ secretores de IL-10 y de IL-2 en adultos durante las fases aguda y de convalescencia de una GE-RV respectivamente; v) la existencia de un mecanismo
regulador de la respuesta de LT IFN-+ específica de RV mediado por células CD25+ y por TGF- derivado o no de células CD25+ en adultos sanos e infectados; vi) la ausencia del mecanismo regulador dependiente de TGF- en niños con GE aguda ó pasada por RV; vii) la
presencia de linfopenia en algunos niños con GE-RV, reportada previamente (Wang et al., 2007), así como la ausencia de alteraciones en el número de los LTreg circulantes; viii) la
susceptibilidad de las CMSP de adultos a la infección por RV in vitro, especialmente de CPA
como las CD; ix) la participación de las CDp en la secreción de IFN- en respuesta a RV, así
como su papel en la estimulación de la producción de IFN- por los LTCD4+ y CD8+ específicos de RV en adultos sanos; y finalmente, x) la aparente resistencia a la infección por
RV de las CMSP de niños con GE aguda por RV.
La ausencia de LT circulantes específicos de RV secretores de IFN- e IL-13 (Jaimes et al., 2002; Rojas et al., 2003) y adicionalmente de IL-2, IL-10 e IL-17 (artículo No.1) en niños con infección aguda por RV a pesar de la existencia de viremia (Blutt et al., 2007) es intrigante porque se espera que la viremia induzca una respuesta sistémica como sucede con CMV,
DV, HIV y los virus de sarampión, rubéola y fiebre amarilla. Es probable que esto se deba a la ausencia de infección, procesamiento y presentación de antígenos de RV por las CMSP de los niños. La aparente ausencia de infección de las CMSP de los niños in vivo a pesar
de la evidencia de infección in vitro podría deberse a una baja concentración de virus en
sangre (Blutt et al., 2007). También es posible que en el grupo de niños con elevada antigenemia, la baja respuesta sistémica de LT se deba a inducción de anergia ó deleción clonal. En efecto, en algunos modelos de Ags administrados por vía oral en altas dosis se produce eliminación o inactivación de LT específicos del Ag (Faria and Weiner, 2005; Goubier et al., 2008). La presencia de LT anérgicos específicos de RV podría evaluarse mediante condiciones que reviertan la anergia tales como el cultivo de CMSP con RV a elevadas dosis ó en presencia de IL-2 (Whitacre et al., 1991), ó de inhibidores de la vía de la diacil glicerol quinasa (DAGK) (Zha et al., 2006). Adicionalmente, un método más directo sería la detección de LT con tetrámeros de CMH/péptidos de RV y evaluación simultánea de la secreción de citocinas mediante tinción intracelular y citometría de flujo; sin embargo, en el momento no se conocen los péptidos de las proteínas de RV susceptibles de presentación por los alotipos de HLA más frecuentes en la población. Alternativamente, si no existieran estos LT, entonces podría concluirse que fueron eliminados activamente. En el supuesto de la existencia de anergia ó eliminación de LT circulantes específicos de RV en los niños, surge una pregunta y es ¿por qué se producen Igs séricas e intestinales para RV?. Esta paradoja que se ha observado previamente en humanos se atribuye a una mayor sensibilidad de los LTh1 vs los LTh2 a la inducción de tolerancia, de modo que los LTh2 efectores podrían sostener el desarrollo de los LB (Husby et al., 1994). Como en el caso de la respuesta inmune a RV no se observan tampoco LTh2 circulantes se podría proponer que los LTh ayudadores de los LB en los folículos linfoides (LTFH) de las PP, (Fazilleau et al., 2009) ó los órganos linfoides secundarios sistémicos serían los efectores responsables de la
generación de Acs IgM, IgG e IgA específicos de RV, con una preponderancia de IgA en el compartimento intestinal donde la abundancia de TGF- favorece la inducción de este isotipo (Faria and Weiner, 2005). Alternativamente, también existe la posibilidad de que algunos Ags de RV se comporten como Ags timo-independientes con un efecto estimulador directo sobre los LB; suposición que se basa en la observación de activación policlonal de LB de la PP en el modelo murino de infección por RV (Blutt et al., 2004). En los niños en los que no se detecta Ag, es importante tener en cuenta que en la respuesta inmune a RV existe una correlación inversa entre la antigenemia y el nivel de Acs séricos; en estos casos, la no detección de Ag podría estar ligada a su secuestro en complejos inmunes circulantes (CIC). En estos casos, la ausencia de respuesta T podría estar asociada con el efecto inmunosupresor de los CIC. De hecho, se ha demostrado que los CI insolubles son captados por las CD a través de receptores activadores como CD32A e inhibidores como CD32B, en una dinámica donde el balance entre las dos señales determina la inducción o la inhibición de una respuesta de LT específicos del Ag (Blutt et al., 2007; Boruchov et al., 2005; Nimmerjahn and Ravetch, 2007). A medida que los contactos con RV se repiten a través de los años, es probable que en los niños mayores y en los adultos los RV sean neutralizados en la mucosa intestinal, que la antigenemia sea menor o nula y que la captación de Ags rotavirales libres o en forma de CI activadores permita la inducción de los LT específicos de RV que se detectan en los adultos. Sería interesante determinar si en la circulación de niños y adultos con infección por RV existen CI circulantes, asi como evaluar los isotipos de Igs presentes en dichos complejos y su potencial como moduladores de la activación de las CD en la inducción de la respuesta T.
En el caso de la respuesta inmune a RV en adultos sanos e infectados, es importante aclarar que aunque en estudios anteriores se había afirmado que la frecuencia de LTCD4+ y CD8+
específicos de RV secretores de IFN- era menor que la respuesta a otros virus, los resultados en diferentes infecciones virales permiten concluir que sí son menores que las respuestas a virus causantes de infecciones persistentes como los de la familia
Herpesviridae pero similares a las de virus que ocasionan infecciones agudas de las
mucosas (Tablas 2 y 3). Además, la detección de LTCD4+ IFN-+ /IL-2+ específicos de RV podría estar asociada con la presencia de un pool celular de LT de memoria característico de
la respuesta a virus que se aclaran (Kannanganat et al., 2007; Seder, Darrah, and Roederer, 2008; Tilton et al., 2007). Su aparición en la fase de convalescencia en adultos luego de una GE aguda por RV sugiere además que esta población celular sólo aparece después de infecciones repetidas y que su ausencia en el 45% de adultos sanos estudiados podría explicar la susceptibilidad de esta población de adultos a una infección más severa por RV.
In vivo, en respuesta a un reto por RV, esta población se expandiría para dar lugar a LT
efectores terminalmente diferenciados que sólo secretan IFN-; esto explicaría el aumento de LT CD4+ IFN-+ observado en adultos durante la fase aguda de la GE-RV. Una vez la respuesta inmune controla al RV, esta población se contrae por apoptosis regresando a los niveles observados en ausencia de infección (Hayashi et al., 2002; Wu et al., 2002). El pool
de LTCD4+IL-2+ también sería crucial para la expansión de LTCD8+ específicos de RV que no producen IL-2 y que por tanto no pueden sostener su propia proliferación de manera autocrina (Seder, Darrah, and Roederer, 2008). Es importante anotar también que la ausencia de LTCD4+IL-2+ específicos de RV durante la fase aguda de la infección de los adultos puede atribuirse a la rápida conversión de los LT multifuncionales en LT efectores IFN-+ que ocurre en presencia de una alta carga viral (Seder, Darrah, and Roederer, 2008). Cuando la carga viral disminuye durante la convalescencia, la subpoblación IL-2+ alcanza un nivel similar al observado en algunos adultos sanos.
La presencia de mecanismos reguladores de la respuesta de LT específicos de RV en adultos pero no en niños, permite postular que como consecuencia de la generación y expansión de LT específicos de RV por contacto repetido con el Ag, a través de los años, se inducen mecanismos de control dependientes de IL-10, TGF- y de células CD25+. La IL-10 producida por LTCD4+ específicos de RV durante la fase aguda de una GE-RV, pero no en la convalescencia, sugiere la presencia de un mecanismo regulador transitorio. Queda por establecer la identidad de estas células. Entre los LTCD4+, la IL-10 es producida por LTh2 (Street and Mosmann, 1991), LTreg CD4+CD25+Foxp3+ (Annunziato et al., 2002; Asseman et al., 1999; Ito et al., 2008), LTr1 (Groux et al., 1997; McGuirk, McCann, and Mills, 2002; Roncarolo et al., 2006), iLTreg del TLAI (Denning et al., 2007) e incluso por LTh1 (Del Prete et al., 1993; Jankovic et al., 2007; O'Garra and Vieira, 2007; Trinchieri, 2007). Como IL-13 e IL-4 no han sido observados en los LT CD4+ de memoria específicos de RV en adultos sanos ni enfermos (Jaimes et al., 2002; Rojas et al., 2003) es poco probable que los LTh2 sean la fuente de la IL-10 observada en el presente trabajo. Los LTreg se consideran tradicionalmente específicos de antígenos propios aunque también se ha mostrado que reconocen Ags de organismos infecciosos tales como Leishmania en el modelo murino
(Suffia et al., 2006) y de HIV (Kinter et al., 2004) y HCV (Cabrera et al., 2004) en humanos. Aunque la existencia de LTreg específicos de RV no puede ser descartada, las condiciones experimentales que se utilizaron en este trabajo no son las mejores para su detección (Ito et al., 2008). Un estudio reciente mostró que la principal fuente de IL-10 entre los LTreg es una subpoblación de LTCD4+ICOS+ que requiere para su sobrevida en 6 d de cultivo, la presencia de CDp ICOSL+ y ausencia de Acs anti-CD28 (Ito et al., 2008). Sería necesario entonces evaluar la expresión de ICOSL en las CDp y la cinética de sobrevida, de los LTCD4+ IL-10+ observados en los cultivos de corto plazo que se emplearon en este trabajo. Por otro lado y aunque los LTr1 Foxp3- se han relacionados más con el estímulo persistente
de las infecciones crónicas (Boussiotis et al., 2000; MacDonald et al., 2002; Marshall, Vickers, and Barker, 2003; Satoguina et al., 2002), éstos también son inducidos durante las infecciones agudas en ratones (Couper et al., 2008; McGuirk, McCann, and Mills, 2002) y humanos (Jangpatarapongsa et al., 2008; Kaplan et al., 2008). Además, los LTr1 están activamente involucrados en la preservación del ambiente tolerante de la mucosa intestinal (Izcue, Coombes, and Powrie, 2006; Roncarolo et al., 2006) y recientemente se mostró en el modelo murino que el intestino es un tejido ideal para la inducción de LTr1 IL-10+ (Denning et al., 2007; Kamanaka et al., 2006). Por estas razones, los LTr1 serían una fuente plausible de la IL-10 observada en los adultos con GE-RV aguda; de hecho, LTr1 específicos de
H.hepaticus se han aislado de NLM de ratones con colitis (Kullberg et al., 2002). Sería
importante evaluar el papel de las CD y macrófagos del TLAI en la inducción de LTr1 en respuesta a RV. Por otro lado, teniendo en cuenta que los LTr1 son inducidos in vitro por
CDp ICOSL+ (Ito et al., 2007) y que mostramos que las CDp inducen secreción de IFN-+ por LT específicos de RV (Mesa et al., 2007), sería crítico determinar la expresión de ICOSL en CDp periféricas extraídas de sujetos con GE-RV o expuestas in vitro al virus, así como su
participación en la inducción de LTr1. En el subgrupo de los LT CD4+, IL-10+ también es producida por LTh1 efectores pero no de memoria, lo cual sugiere que su secreción se induce durante la respuesta como un mecanismo de regulación (Dong et al., 2007). LT CD4+ IFN-+/IL-10+ han sido aislados entre los clonos de LT humanos poliespecíficos expandidos en presencie de IL-12 (Gerosa et al., 1996), clonos de LT derivados de lavado broncoalveolar de pacientes con tuberculosis activa (Gerosa et al., 1999), líneas de LT específicos de Borrelia (Pohl-Koppe et al., 1998) y recientemente en modelos murinos de Leishmania (Anderson et al., 2007) y Toxoplasma donde la naturaleza Th1 de estas células
fué claramente establecida por la expresión de t-bet (Jankovic et al., 2007). Sin embargo, estas son infecciones crónicas que inducen una fuerte polarización hacia Th1 a través de la
IL-12 derivada de las CD, la cual no observamos en los cultivos in vitro de CMSP humanas ni
de CDm derivadas de monocitos humanos expuestas a RV (Mesa et al., 2007; Narvaez, Angel, and Franco, 2005). No obstante, como encontramos que el IFN- derivado de las CDp dirige la secreción de IFN- por los LT de memoria en adultos sanos (Mesa et al., 2007), sería interesante analizar si las CDp pueden inducir también la secreción de IL-10 en LTh1 IFN-+ específicos de RV durante los episodios agudos de GE-RV. Esta posibilidad tiene respaldo en la observación de que LTCD4+ IFN-+/IL-10+ se generan en cultivos de LT humanos en presencia de CDp inmaduras (Cella et al., 2000) y de CDp expuestas a VHS (Kadowaki et al., 2000). En resumen, la identidad definitiva de los LTCD4+ específicos de RV secretores de IL-10 observados en la fase aguda de la GE-RV en adultos demandará análisis fenotípicos y funcionales detallados.
Adicionalmente al mecanismo regulador mediado por IL-10 de la fase aguda de la GE-RV, también se evidenciaron mecanismos reguladores de la respuesta de LT IFN-+ específicos de RV mediados por células CD25+ y TGF- en la mayoría de adultos sanos. Los experimentos permitieron establecer que el TGF- podría provenir de las células CD25+ así como de otras fuentes celulares presentes en el cultivo como monocitos y células NK, las cuales, han sido descritas como las principales fuentes celulares de esta citocina (Miller et al., 1992). En algunos individuos no se observaron cambios en la frecuencia de LT IFN-+ específicos de RV después de remoción de las células CD25+. Este hallazgo podría deberse a la remoción de LT CD25+ recientemente activados ó a la existencia de un mecanismo regulador independiente de este grupo celular. Así mismo, en algunos individuos la inhibición del TGF- no incrementó la frecuencia de los LT específicos de RV, sugiriendo su ausencia ó alternativamente la participación de mecanismos reguladores diferentes mediados, por ejemplo, por IL-10, IL-35, Adenosina, etc. (Vignali, Collison, and
Workman, 2008). También se observó que el mecanismo regulador mediado por TGF-
existe en adultos durante la fase aguda de GE-RV así como durante la convalescencia en algunos de ellos. En el futuro serán necesarios estudios adicionales para comparar el aporte de TGF- de los LTreg CD25+versus otras fuentes celulares en la regulación de la respuesta inmune de LT IFN-+ específicos de RV; posiblemente la inhibición del TGF- mediante ARN de interferencia (ARN i) en poblaciones celulares purificadas podría utilizarse para resolver esta pregunta.
En contraste con los adultos, el TGF- parece no estar involucrado en un control de la respuesta de LT específicos de RV en los niños; incluso, el hallazgo de números normales de LTreg TGF-+ en sangre periférica de niños con GE-RV sugiere que a pesar de su presencia no participan en ese proceso, bien sea por inmadurez o por ausencia de su blanco, los LT efectores específicos de RV. En cuanto a la primera hipótesis, es relevante la observación de algunos estudios en niños con infección por HIV ó Neisseria en los cuales
tampoco se ha evidenciado actividad de LTreg (Davenport et al., 2007; Legrand et al., 2006). Es importante señalar también que en los niños los LT efectores tienen una vida media más corta que los LTreg; en efecto, se ha observado que los LT efectores de sangre de cordón (Li et al., 2004; Thornton et al., 2004) y de niños de 12 m (Upham et al., 2006) son más susceptibles a apoptosis que los LTreg CD45RA+ (Thornton et al., 2004), de modo que es posible suponer que en los niños con GE-RV se podrían inducir LT efectores específicos de RV que morirían rápidamente mientras que los LTreg permanecerían durante más tiempo. Adicionalmente, varios estudios han mostrado que comparados con los LTreg de adultos, los LTreg de sangre de cordón son incapaces de modular respuestas de LT efectores a mitógenos (Wing et al., 2005), aloAgs (Chang et al., 2005; Thornton et al., 2004; Wing et al., 2005), auto-Ags y Ags extraños (Wing et al., 2003). Sin embargo, resultados contradictorios
que muestran en los niños resultados similares a los de adultos también se han observado en respuesta a los mismos estímulos (Brustoski et al., 2006; Chang et al., 2005; Fritzsching et al., 2006; Legrand et al., 2006; Santner-Nanan et al., 2008; Schaub et al., 2008; Seddiki et al., 2006a; Seddiki et al., 2006b; Smith et al., 2008; Takahata et al., 2004; Wing et al., 2005; Wing et al., 2003). Aunque las divergencias han sido atribuidas a condiciones experimentales diferentes, es claro que la mayoría de LTreg de sangre de cordón son LT vírgenes CD45RA+ CD38+, a diferencia de los de adultos que son principalmente de memoria, CD45RO+HLA- DR+ (Takahata et al., 2004; Wing et al., 2002); y que los LTreg de sangre de cordón expresan menos ARN m para IL-10 que los de adultos (Takahata et al., 2004). Sin embargo , cuando los LTreg vírgenes CD45RA+ de sangre de cordón y de sangre periférica de adultos (Fritzsching et al., 2006; Seddiki et al., 2006b) se comparan, muestran respuestas igualmente reducidas (Fujimaki et al., 2008). Por esta razón, sólo cuando la activación es lo suficientemente fuerte, tal como la inducida por mitógenos y estímulos alogénicos o en respuesta a un re-estímulo (Chang et al., 2005; Thornton et al., 2004), los LTreg de sangre de cordón se pueden activar completamente y muestran función supresora como la de los adultos. Si estas características se mantienen en los LTreg de los niños podrían explicar el que el tratamiento con ALK5i revele una mayor frecuencia de LT IFN-+ en respuesta a SEB en algunos de los pacientes pediátricos con GE-RV analizados en el presente trabajo. También es importante considerar que los LTreg de niños puedan modular la respuesta inmune a través de mecanismos diferentes a TGF-. Una simple estrategia para determinar el papel de los LTreg CD25+ eran los experimentos de remoción; sin embargo, el escaso volumen de las muestras de sangre de los niños no permitió realizar este análisis. Se necesitan más estudios entonces para analizar el papel de los LTreg y de mecanismos independientes de TGF- en la respuesta inmune a RV en los niños. Adicionalmente, se necesita una evaluación del papel de los LTreg en la respuesta a RV en el TLAI ya que un
estudio reciente en el modelo murino mostró que los LTreg CD4+CD25+Foxp3+ se incrementan en bazo y NLM de ratones con GE-RV y que son capaces de suprimir las respuestas de LT y LB específicos días después del aclaramiento viral, mediante mecanismos relacionados con un aumento de los niveles de IL-10 y TGF- en los tejidos analizados (Kim et al., 2008).
La hipótesis de ausencia de LT efectores circulantes específicos de RV en los niños podría estar asociada a la linfopenia previamente descrita (Wang et al., 2007) ó a defectos en su inducción. En este trabajo se encontró linfopenia sólo en 5/12 (41.6%) niños con GE-RV; pero tanto en ellos como en los niños sin linfopenia, las frecuencias de LT IFN-+ específicos de RV fue nula, de modo que esta hipótesis no explica la baja respuesta T contra RV en los