COMPLICATIONS
11. Ischemic complications
Se llevó a cabo la síntesis de distintos peptidilaminoalcoholes catalizada por endopeptidasas de origen vegetal tanto inmovilizadas en poliamida como libres. Se utilizaron distintos medios y las reacciones se llevaron a cabo tanto bajo control termodinámico como cinético.
Las condiciones óptimas encontradas para la síntesis de los compuestos planteados fueron el desarrollo de la reacción bajo control termodinámico (Z-Ala en lugar de Z-Ala-OMe como dador de acilo), mezcla equimolar de sustratos (pH 7,0), ACN con 1% (v/v) de agua como medio de reacción y las enzimas inmovilizadas.
Las dos enzimas inmovilizadas fueron efectivos catalizadores en la síntesis de tres productos: Z-Ala-glicinol, Z-Ala- -alaninol y el producto c que, en medio acido genera Z-Ala-β-alaninal y su hidrato. De esta forma se demostró la flexibilidad en el subsitio S1´ de ambas enzimas. Por el contrario, la flexibilidad del subsidio S1 no fue suficiente para aceptar
O N H H N O O O O O N H H N O O O EtOH H+ EtOH O N H H N OH O O OH H2O H2O
el β-aminoácido ensayado, por lo que se concluye que su especificidad estaría limitada a
α-aminoácidos.
La gran flexibilidad de estos biocatalizadores para reaccionar frente a sustratos tales como aminoalcoholes y aminoacetales los convierte en herramientas muy útiles para la obtención de peptidil amino alcoholes y péptido aldehídos, compuestos que son intermediarios en la síntesis de isósteros peptídicos en la industria farmacéutica.
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Conclusiones generales del trabajo:
- A partir del desarrollo de este trabajo de tesis adquirí, a través de una extensa práctica concreta, los conceptos básicos para el planteamiento, la organización, la realización y la conclusión de un trabajo de investigación. Además incorporé también la capacidad de replantear métodos y estrategias de acuerdo a los distintos resultados.
- Conocí y me entrené en un gran número de técnicas de laboratorio como las de medidas de actividad, electroforesis, isoelectroenfoque, purificación e inmovilización de proteínas, entre otras. También en el uso de diversos equipos de laboratorio como el espectrofotómetro, el espectrofluorómetro, equipos de cromatografía líquida, HPLC- MS, liofilizador, rotavapor entre otros. Y, en la interpretación de los resultados de los ensayos usando estos equipos así como de ensayos provenientes de EM MALDI-TOF y FTIR-ATR.
- Aprendí a realizar búsquedas de material bibliográfico y a seleccionar los más útiles para el desarrollo del plan proyectado y para la incorporación de nuevas ideas al mismo.
- Trabajé como parte de un grupo de investigación y también en colaboración con distintos miembros del LIPROVE como investigadores, becarios y estudiantes y, por otro lado con grupos de otras unidades de investigación como el CINDECA.
- Por último, también pude ser capaz de presentar los resultados del trabajo de investigación en distintos formatos como informes periódicos, posters y presentaciones orales en congresos y publicaciones en revistas.
Conclusiones específicas del trabajo
:En el Capítulo 1, en primer término, se describió la obtención de extractos enzimáticos de papaína y araujiaína en buenas cantidades y a muy bajos costos.
Posteriormente se detallaron las medidas de estabilidad realizadas en distintos solventes. El empleo de isooctano no afectó la estabilidad de papaína y araujiaína. En cambio, el dioxano en proporciones del 30, 50 y 70% (v/v) provocó la pérdida total de actividad luego de 6 hs de incubación en los dos extractos enzimáticos ensayados. El MeOH en bajas proporciones (30, 50 y 70%) y el ACN en altas (90 y 99%) no afectaron la actividad del extracto de papaína, mientras que redujeron en un 50% la actividad de araujiaína. En ACN 30, 50 y 70% ocurrió una reducción del 50% de actividad en ambos extractos, mientras que en DMF la reducción de actividad fue proporcional a la cantidad de solvente, entre un 10 a 30% de caída en el caso de DMF 30% y entre un 70 y 100% en DMF 70%. En MeOH y DMF en altas proporciones la papaína conserva un 40 y un 20% de su actividad, respctivamente, mientras que araujiaína la pierde completamente. En general, los efectos de los solventes sobre araujiaína fueron más drásticos que los observados sobre papaína.
El ACN en todas las proporciones y el MeOH en proporciones bajas mostraron ser solventes que no afectaron notablemente la actividad de las enzimas, lo que no fue observado para DMF. ACN y MeOH podrían ser así solventes de elección a la hora de realizar ensayos biocatalíticos.
Asimismo se determinó que el extracto crudo de papaína y la papaína purificada presentaron un comportamiento catalítico similar al exponerse a ACN, MeOH y DMF en altas proporciones.
En el Capítulo 2 se describieron los análisis espectroscópicos de fluorescencia y FTIR-ATR realizados para profundizar el estudio de estabilidad de papaína en mezclas acuoso-orgánicas. En ellos se observó que papaína presentó una estructura ligeramente más compacta y estructurada en todos los medios investigados [ACN, MeOH y DMF 90 y 99% (v/v)] que la que presenta en un ambiente acuoso. Sin embargo, excluyendo lo ocurrido en DMF 99%, no se detectaron grandes cambios en las estructuras secundarias.
En ACN se vio que la actividad de papaína variaba muy poco a pesar de la mayor estructuración que mostraron los estudios por fluorescencia. El MeOH provocó que la actividad enzimática descendiera hasta un 20% de la observada en buffer. Este descenco se
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vio acompañado por aumentos leves de hélices α y láminas β en MeOH 90% y de láminas y giros β en MeOH 99%, observados mediante espectroscopía FTIR-ATR. Por otra parte mediante los estudios de fluorescencia no se vieron cambios importantes. DMF demostró ser el solvente más agresivo de los tres ensayados en este estudio, ya que provocó la inactivación de la papaína. Esto fue acompañado por cambios irreversibles en la estructura terciaria evidenciados por desplazamientos en los λmax de los espectros de FI y por los espectros ANS y
FRET. En DMF 99%, además se observó un gran aumento de láminas b y descenso en las demás estructuras.
En el Capítulo 2 también se describió la purificación de papaína mediante un método simple. La purificación constó de dos pasos de precipitación con (NH4)2SO4 y un paso de
precipitación con NaCl, mediante los cuales se separó papaína de las otras proteasas en presencia de TT 30 mM en todos los pasos, obteniéndose rendimientos de alrededor del 3%. Para determinar la pureza del producto se usaron variadas técnicas: SDS-PAGE, IEF y zimogramas, cromatografías de intercambio iónico, espectrometría de masas MALDI-TOF y análisis de la huella peptídica. Se confirmó que el producto purificado contenía papaína pura y que las escasas impurezas observadas fueron péptidos provenientes de los cuatro proteasas presentes en el látex de Carica papaya.
En el Capítulo 3 se detalló el procedimiento utilizado para inmovilizar araujiaína sobre dióxido de titanio mediante adsorción simple. Se observó, en el mismo, que la adsorción de proteasas es altamente selectiva y muy rápida. La actividad recuperada en el biocatalizador con respecto a la del extracto crudo es de un 8% al medir actividad amidásica. Además, se comprobó que los fenómenos de desorción enzimática en medios acuosos son un grave problema para el uso y la reutilización de estos biocatalizadores en este tipo de medios y que este fenómeno es más importante a medida que aumenta la fuerza iónica del medio.
Por otra parte, se profundizó el estudio de biocatalizadores preparados con papaína y araujiaína en poliamida. Se observó que se recupera el 17% de la actividad luego de la inmovilización en el caso de araujiaína y el 9% para papaína.
En medios acuosos se observó que existe una desorción de enzimas muy importante, siendo ésta más pronunciada en el caso de Ara/pol. Por último, se vio que tanto Ara/pol, como Pap/pol fueron activos frente a los sustratos sintéticos ensayados, siendo el derivado de Ala el preferido de ambos.
En el Capítulo 4 se describió la optimización de las reacciones de síntesis propuestas. Las condiciones óptimas encontradas para la síntesis de los peptidilaminoalcoholes fueron el desarrollo de la reacción bajo control termodinámico, mezcla equimolar de sustratos (pH 7,0), ACN con 1% (v/v) de agua como medio de reacción y las enzimas inmovilizadas. Por otra parte se encontró que las dos enzimas inmovilizadas fueron efectivos catalizadores en la síntesis de tres productos: Z-Ala-glicinol, Z-Ala- -alaninol y Z-Ala-alaninal, con rendimientos entre 60 y 95%. En cambio, ninguno de los dos biocatalizadores fue capaz de aceptar como sustrato el Z-β-Ala, demostrando una alta selectividad por α-aminoácidos.
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