2.2.1. Cultivos celulares.
Se utilizó como sistema modelo in viíro el cultivo de dos líneas clonadas de células osteoblasto- símiles: UMR106, derivada de un osteosarcoma de rata, y una línea de células no transformadas MC3T3E1, derivada de calvaria de ratón.
En particular, la línea MC3T3-E1 es un tipo de células que expresan diferentes genes y marcadores osteoblásticos en función del tiempo de cultivo, pasando secuencialmente por los estadios de proliferación, diferenciación y mineralización. Estudios previos han demostrado que el cultivo de estas células en un medio suplementado con p-glicerofosfato 5 mM y ácido ascórbico 140 pM, induce su progresión a través de etapas de desarrollo muy similares a las observadas en cultivos primarios de osteoblastos. Este modelo in vitro refleja en gran medida los
procesos de desarrollo del hueso in vivo (Quarles et al 1992).
La línea de células UMR106 expresa marcadores de un fenotipo osteoblástico diferenciado. Éstos incluyen la expresión de fosfatasa alcalina ósea, la síntesis de colágeno de tipo I y la regulación de niveles intracelulares de AMP cíclico por PTH, entre otros marcadores (Partridge et al 1983).
Ambas líneas de células fueron cultivadas en frascos de plástico de 75 cm^ a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % CO2, en un medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM),
suplementado con 10 % de suero bovino fetal (FBS), penicilina (100 Ul/ml) y estreptomicina (100 pg/ml). Después de 3 a 5 dias (el tiempo necesario para que lleguen a subconfluencia), las células se cosecharon usando tripsina-EDTA en PBS para resuspenderlas. Una fracción de células se diluyó 1:10 en DMEM con 10 % FBS para contimuar el cultivo y la otra fracción se utilizó para realizar los experimentos. Las células se plaquearon en platos de 24 ó 48 pocilios, a una densidad de plaqueo de 2,5 x 10"^ células / pocilio. Luego se cultivaron en DMEM con 10 % FBS hasta llegar nuevamente a la subconfluencia deseada, se lavaron dos veces con DMEM y se incubaron en DMEM sin suero (para evitar la influencia de los factores de crecimiento propios del suero), en presencia de los complejos de vanadio (cuya acción sobre la proliferación celular se está investigando), de acuerdo con lo requerido para cada ensayo en particular. En los casos en los cuales se estudió el efecto de los compuestos de vanadio en los diferentes estadios de diferenciación, las células MC3T3-E1 confluentes se incubaron en DMEM suplementado con suero bovino fetal (10 %), penicilina (100 Ul/ml), estreptomicina (100 p.g/ml), anfotericina B (0,3 |ig/ml), ácido ascórbico (25 pg/ml) y (3-glicerolfosfato (5 mM). Este medio de cultivo se cambió cada dos días.
2.2.2. Ensayo de proliferación celular.
2.2.3. Bioensayo del Cristal violeta.
La proliferación celular se estimó por medio del ensayo mitogénico del cristal violeta (Okajima et al 1992). El fundamento de este ensayo se basa en el hecho de que el cristal violeta es incorporado por ciertas estructuras subcelulares, en particular por las mitocondrias de las células metabólicamente activas, pero no por células inactivas. En nuestros experimentos, los cultivos se
Materiales y Métodos
fijaron con glutaraldehído al 5 % en PBS y se colorearon con cristal violeta al 0,5 %. El colorante incorporado por las células se extrajo con buffer glicina / HCl pH=3,0 que contiene 30 % de metanol. El extracto se diluyó adecuadamente con agua destilada y se midió la absorbancia a 540 nm. Previamente, se demostró que los valores de absorbancia obtenidos con este ensayo correlacionan en forma directa con el recuento de células vivas en cámara de Neubauer (r= 0,897; p< 0,001) (Cortizo y Etcheverry 1995).
2.2.4. Ensayos de diferenciación celular.
2.2.4.1. Actividad específica de FAL.
Con el objeto de medir la actividad específica de FAL en los osteoblastos, la monocapa de células en cultivo se solubilizó con 0,1 % de Tritón X-100. Se utilizaron alícuotas de este extracto celular total para determinar la concentración de proteínas por el método de Bradford. La actividad de FAL del extracto se determinó luego por incubación de una alícuota del mismo con el sustrato p- NPP 5 mM en un buffer glicina 55mM / MgCb 0,55mM pH=10,5, a 37 °C durante 10 minutos. La producción de /?-NP se determinó midiendo la absorbancia a 405 nm (Cortizo y Etcheverry 1995). La actividad celular específica de FAL se expresó en nmol p-NP / min x mg proteína total. La FAL es un marcador de fenotipo osteoblástico maduro, y por ese motivo, la determinación de su actividad específica es utilizada para evaluar el grado de diferenciación en este tipo de cultivos (Stein y Lian 1993; Cortizo y Etcheverry 1995).
2.2.4.2. Determinación de colágeno
La síntesis de colágeno tipo I es una característica del fenotipo osteoblástico. Se utilizó un método histoquímico adaptado para determinar el colágeno producido por osteoblastos (Tullberg- Reinert y Jundt 1999). Las células se cultivaron bajo diferentes condiciones experimentales en platos multipocillos. Luego, se lavaron tres veces con PBS y se fijaron 1 hora con 1 mi de solución fijadora (15 mi de solución de ácido pícrico / 5 mi de formaldehído al 35 % y 1 mi de ácido acético glacial). Posteriormente, se lavaron 15 minutos con H20(d) con agitación suave y se colorearon 1 hora con 1 mi de colorante (100 mg de Sirius Red en 100 mi de una solución
saturada de ácido pícrico), también con agitación suave. Seguidamente, se lavaron con HCl 0,01 N hasta sacar todo el exceso de Sirius Red. El colágeno producido por las células se observó con microscopio óptico y se fotografió. A continuación, el colorante fijado al colágeno se extrajo con 1 mi de NaOH 0,1 N con agitación suave por el término de 30 minutos. Luego, se determinó la absorbancia a 550 nm. El contenido de colágeno producido por los osteoblastos se obtiene de la curva de calibración (pg de colágeno vs absorbancia).
2.2.5. Consumo de glucosa por los osteoblastos.
El consumo de glucosa por los osteoblastos se determinó indirectamente midiendo la concentración de glucosa remanente en el medio de cultivo de las células, luego de la incubación de las mismas con los derivados de vanadio, utilizando para ello el método de la glucosa oxidasa (Trinder 1969; Okajima et al 1992). Una vez que los osteoblastos alcanzaron la confluencia en los pocilios, la monocapa de células se lavó dos veces con DMEM con baja concentración de glucosa (1,0 g /1) y las células se ayunaron toda la noche en este medio. Finalmente, las células se incubaron en este medio en presencia de los complejos de vanadio por un tiempo preestablecido (entre 4 y 8 horas, tiempo en el cual el consumo de glucosa es lineal), se tomó una alícuota del medio de cultivo y se determinó el contenido de glucosa remanente. La monocapa de células se solubilizó en 0,1 % de Tritón X-100 y se determinó proteínas totales por el método de Bradford (Bradford 1976). El consumo de glucosa por los osteoblastos se expresó como; (pg de glucosa inicial - pg de glucosa final) / mg de proteínas totales en cada pocilio.