2.3 Analysis
2.3.1 Kinematic Modeling
3.1 Determinación de extractos
De 2 kg de planta seca y molida, por maceración, se obtuvo 52,638 (2,63%) g de extracto clorofórmico, (ECF) de color verduzco y de apariencia pastosa.
3.2. Cromatografía líquida al vacío
De 10 g de extracto clorofórmico(ECF) se obtuvo seis fracciones mediante la aplicación de Cromatografía Líquida al vacio (CLV), los colores y pesos obtenidos se muestran en el Cuadro 5.
Cuadro 5: Fracciones de cromatografía líquida al vacío
Fracción Color Peso(g) Porcentaje FHE1 Amarillo claro 0,624 6,17 FCF1 Amarillo oscuro 1,343 13,27 FCF2 Verde petróleo 2,469 24,40 FAE1 Verde negrusco 2,482 24,53 FAE2 Verde oscuro 2,600 25,69 FME1 Verde oscuro 0,600 5,9
3.3. CROMATOGRAFIA DE COLUMNA
Se pesó 2,9284 g de la fracción FCF2 y se cromatografiaron en columna (CC) usando Silica gel como soporte y como sistemas eluyentes CHCl3: EP(9:1), CHCl3 : EP (8,5: 1,5),y metanol puro.
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El fraccionamiento fue monitoreado mediante Cromatografía de capa fina (CCF), y se reunieron seis fracciones, E1 a E6, basado en la similitud de sus cromatogramas. (ver Cuadro 6)
Cuadro 6 Fracciones de Cromatografía de Columna de FCF2
Fracción manchas color soluble en peso mg E1 1 anaranjado CHCl3-EP 24,5
E2 3 amarillo CHCl3 –EP 32,3
E3 2 amarillo claro CHCl3-EP 9,2
E4 3 verde oscuro CHCl3 – EP 17,4 E5 4 marrón CH Cl3 –EP 11,5 E6 1 verde oscuro CH3OH 151,2 E7 - Marrón claro CHCl3 100,8 E8 - Marrón claro CHCl3 48,1 E9 - verde oscuro CHCl3 96,8
Estas fracciones se obtuvieron de la fracción FCF2 que presentó actividad positiva en las pruebas farmacológicas.
3.4. Determinación de grupos de metabolitos secundarios
Las determinaciones cualitativas en el extracto clorofórmico y las fracciones fueron deducidas de las coloraciones observadas y se muestran en los cuadros 2 y 3.
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Cuadro 7: Metabolitos Secundarios identificados en ECF
Prueba Color Metabolito Resultado Shinoda Azul Flavona +
FeCl3 Verde petróleo Fenólicos +
Liberman Burch Verde azulado Esteroides + Dragendorf Rojo (ppdo) Alcaloides + Mayer Blanco(ppdo) Alcaloides + Wagner Marrón Alcaloides - Prueba de espuma Igual a la muestra Saponinas -
Gelatina-Sal Blanco (ppdo) Taninos +
Cuadro 8 : Metabolitos Secundarios identificados de la Cromatografía Líquida al vacío de ECFC
Fracción Ensayo Metabolito Resultado
Shinoda Flavanonas + FeCl3 Comp. Fenólicos +
FCF1 Dragendorf Alcaloides -
Mayer Alcaloide + Wagner Alcaloides +
Espuma No saponinas - Gelatina sal Taninos + Shinoda Flavanonas + FeCl3 Comp. Fenólicos +
FCF2 Dragendorf Alcaloides -
Mayer Alcaloides -
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Wagner Alcaloides -
Espuma Saponinas - Gelatina sal Taninos + Shinoda Flavanonas + FeCl3 Comp. Fenólicos +
FAE1 Dragendorf Alcalóides -
Mayer Alcalóides - Wagner Alcalóides -
Espuma Saponinas - Gelatina sal Taninos +
Shinoda Flavanonas + FeCl3 Comp. Fenóñicos + FAE2 Dragendorf Alcalóides -
Mayer Alcalóides - Wagner Alcalóides -
Espuma Saponinas - Gelatina sal Taninos + Shinoda Flavanonas + FeCl3 Comp. Fenólicos +
FME1 Dragendorf Alcaloides -
Mayer Alcaloides + Wagner Alcalóides +
Espuma Saponinas - Gelatina sal Taninos +
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3.5. Obtención de Espectros
El análisis espectroscópico de Resonancia Magnética de Protón (RMN1H) se llevó a cabo en un equipo Bruker de 200MHz
usando cloroformo deuterado como solvente. Para la cromatografía de gases – Espectrometría de masas (CG – EM) se empleo como solvente cloroformo comercial. Los análisis de los espectros de ambas técnicas permitieron identificar los productos naturales que aparecen en el Cuadro 9.
Cuadro 9. Compuestos Encontrados en las Fracciones E1 a E6 y CF2 de la Myrcianthes myrsinoides (HBK).Grifo
Fracción Compuesto tr (min) Peso Molecular E1 Trans-12,13-Epxoiestearato de metilo 20,280 354
E2 Acido 3-Nitro-1,2-bencenodicarboxilico 20,245 279 E4 (1 R,S, 4 ,7 ,7 )-Decahidro-1,1,7-
trimetil-4-metilen-1H-ciclopro[e]azulen-7-
-ol. S-1, de nombre vulgar Espatulenol. 11,563 220 E5 Metil commato 23,140 321 E6 Metil crommato 23,140 321 FCF2
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Espatulenol 11,563 2203.6. Actividad Hipoglucemiante
En el cuadro 10 se presenta el promedio y la desviación estándar calculadas con las observaciones obtenidas en el experimento para cada tiempo de observación y; correspondiendo las primeras dos filas a los 20 sujetos de la experiencia. Las siguientes filas corresponden a los sujetos asignados para cada condición experimental.
Cuadro 10. Promedio para cada tiempo de observación en el grupo total y cada tratamiento.
Tiempo en minutos Solución
Administrada Basal
60 90 120 150
Media Des. Est Media Des. Est Media Des. Est Media Des. Est Media Des. Est Glucosa al 50% 59.2 19.2 78.1 38.0 110.4 31.5 123.4 24.9 104.4 25.7 Glucosa al 50%+ FCF 76.6 24.7 119.8 26.6 119.3 26.2 97.3 28.8 89.3 27.3 Glucosa al 50% 62.9 27.5 92.4 41.8 115.6 18.9 127.3 10.9 109.6 10.1 Glucosa al 50% +FCF2 (1) 58.1 20.5 108.1 32.7 100.4 24.3 76.7 16.9 67.0 17.7 Glucosa al 50% 58.9 10.7 63.0 21.8 92.3 34.1 106.9 28.5 92.3 34.8 Glucosa al 50% +FCF2 (2) 78.7 26.6 124.6 20.3 122.3 22.9 94.3 23.6 87.6 25.0 Glucosa al 50% 55.3 17.8 78.8 47.2 125.5 34.4 138.2 24.0 112.5 24.6 Glucosa al 50% +FCF2 (3) 95.5 7.7 127.8 24.6 137.8 18.5 124.8 24.9 117.2 8.1 Leyenda: Tratamiento 1: 2 mL de glucosa al 50% + 2mL de FCF2 0,257mg/Kg Tratamietnto2: 2 mL de glucosa al 50% + 2mL de FCF2 0,133mg/Kg Tratamiento 3: 2 mL de glucosa al 50% + 2mL de FCF2 0,067mg/Kg
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DE POSGRADO
Las Figuras 3 a 6 muestran las curvas de tolerancia a la glucosa del grupo total sin tratamiento, asi como también la curva de tolerancia a la glucosa con los tratamientos 1, 2 y 3 respectivamente.
Figura 3: Curva de Tolerancia a la Glucosa
Figura 4. Actividad Hipoglucemiante de FCF2 Dosis 0,257mg/kg
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Figura 5. Actividad hipoglucemiante de FCF2 Dosis 0,133 mg/kg
Figura 6. Actividad Hipoglucemiante de FCF2 Dosis 0,0675 mg/kg
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3.4. Actividad Antibacterial
El ensayo antibacterial del extracto clorofórmico puro y la fracción FCF2 frente a la Staphylococcus auresus fue positivo.
La prueba con la Echerichia coli dió resultado negativo con
el extracto clorofórmico (ECF) puro y las fracciones FCF1, FCF2, FAE1 y FHex . La inhibición del control, Amikacina mostró una zona de al menos 7 mm después de 24 horas de exposición en todos los ensayos de prueba. Especies de plantas que presenten como mínimo 7 mm,15 se consideran antibacterialmente activos.
El halo mostrado con la fracción FCF2 es de 12 mm y del extracto clorofórmico puro( ECF) es de 8 mm, por lo que se considera prueba positiva para la actividad antibacterial frente a la bacteria
Staphylococcus auresus
ANALISIS ESTADISTICO DE LOS DATOS EXPERIMENTALES A continuación se presenta el cuadro 11 de análisis de varianza para el índice de tolerancia de glucosa en las tres condiciones experimentales (tratamientos) considerando los cinco tiempos de evaluación (ocasiones)
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Cuadro 11. Análisis de varianza de las tres condiciones experimentales en los cinco te tiempos de evaluación
Fuente de Variación
Grados de
libertad Suma de Cuadrados Cuadrado Medio Razón F F de tabla Valor p Decisión
Ocasiones 4 28726.34 7181.58 25.36 2.507 7.1E-13 Rechazar Ho: Media de ocasiones son iguales Tratamientos 2 24062.19 12031.09 42.48 3.132 1.1E-12 Rechazar Ho: Media de tratamientos son iguales Ocasiones x Tratamientos 8 2350.71 293.84 1.04 2.078 0.4171 Aceptar Ho: Media de las interacciones de ocasiones por Tratamientos son iguales Sujetos 17 22235.50 1307.97 4.62 1.775 2.7E-06 Rechazar Ho: Media de sujetos son iguales Error 68 19257.90 283.20 Total Corregido 99 96632.64
Como se puede observar en la Figura 7 se grafica los promedios por tratamiento en las cinco ocasiones de medición se presenta un patrón creciente y luego decreciente; esto nos indica que estos perfiles de los promedios difieren significativamente de una línea horizontal.
En el cuadro 12 se presentan para cada grupo de sujetos en cada condición experimental el promedio y la varianza de las pendientes.
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Perfiles de promedios del índice de glucosa en sangre por tiempo de evaluación según dosis de FCF2
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 120.0 140.0 160.0 Basal 60 90 120 150 Tiempo de medición Ind ic e de gl uc os a e n s a ng re Trat 1 Trat 2 Trat 3 1
Figura 7: Perfiles del promedio de índice de glucosa en sangre por tiempo de
evaluación según dosis de FCF2
.
Cuadro 12 : Análisis de las pendientes de la curva de tolerancia a la glucosa de los tres tratamientos en los cuatro tiempos de medición.
Pendientes Trat 1 versus Trat 3 Trat 2 versus Trat 3 Trat 1 Promedio -0.490 -0.340 Numerador de t -0.313 Numerador de t
Varianza 0.0488 0.116 Denominador t 0.1339 Denominador t -2.94 T -2.347 T
Trat 2 Promedio -0.463 0.013 valor p de la t 0.0392 valor p de la t Varianza 0.0807 Trat 3 Promedio -0.150 Varianza 0.0385 1
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DE POSGRADO
V.
DISCUSIÓN
La muestra seca y molida fue sometida a maceración con cloroformo por espacio de 7 días y se obtuvo un extracto (ECF) verduzco pastoso de 52,638 g (2,63%) del cual se usó 10 g para ser sometidos a una columna líquida al vacío (CLV), usando como eluyentes hexano, cloroformo, acetato de etilo y metanol; de esta columna cromatográfica se logro separar seis fracciones FHex, FCF1, FCF2, FAE1 , FAE2 y FME1 siendo las fracciones FCF2 y FAE2 las de mayor peso (2,469g, 2,60 g)
Con el extracto clorofórmico (ECF) se realizó ensayos a la gota identificándose la presencia de flavonoides compuestos fenólicos, esteroides y taninos; confirmando lo que se ha reportado en los estudios realizados para especies de esta familia como se muestran en los cuadros 2, 3 y 4.8,7,6 Los ensayos para los alcaloides dieron positivo solo en dos pruebas, Dragendorff y Mayer, pero negativo con Wagner por lo que no se puede afirmar que haya presencia de alcaloides, ya que es necesario resultado positivo por lo menos en los tres ensayos para afirmar que existe presencia de alcaloides; la prueba de espuma fue negativa por lo que la presencia de saponinas es nula.
Los ensayos a la gota realizados con las fracciones demuestran la presencia de flavanoides, compuestos fenólicos, estructuras terpenoidales y taninos para las fracciones FCF1, FCF2, FAE1 , y FME1. En la fracción FAE2 la presencia de flavonoides es nula y en
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ninguna de las fracciones se encontró presencia de alcaloides y saponinas como puede apreciarse en el cuadro 8.
La cromatografía de columna (CC) e la fracción FCF2, rindió nuevas fracciones identificadas como E1 a E6 , el fraccionamiento de FCF2 se realizó debido al resultado positivo de esta fracción para la actividad hipoglucemiante y antibacterial. Las características de estas fracciones se presentan en el cuadro 6. Las coloraciones obtenidas muestran la presencia de flavonoides compuestos fenólicos, estructuras terpenoidales y taninos como indica las pruebas de coloración para esta fracción ver cuadro 7.
Los compuestos identificados en E1 y E2 corresponden a ácidos grasos. Como puede observarse en los espectros de masa que aparecen en las Figuras 8 y 9. Los tiempos de retención (tr) son: 20,280 min , 20,245 min y los pesos moleculares de 354 y 279 g/mol respectivamente. En la fracción E4 se identificó un sesquiterpeno con un tiempo de retención de 11,563 y peso molecular 222 g/mol como puede apreciarse en el espectro de masa de la Figura 9. En E5 y E6 se identificó un triterpeno con tiempo de retención 23,140 min y peso molecular 321 como puede leerse de la Figura 13. En la fracción FCF2 se identificó el mismo sesquiterpeno que en E4. En E3 no fue posible identificar alguna estructura.
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La fracción FCF2 presentó un efecto positivo frente a los ensayos farmacológicos, la cromatografía de gases mostró un componente mayoritario a un tiempo de retención de 11,563 minutos.
Esta misma sustancia fue separada mediante cromatografía de columna ubicándosela en la fracción E4 con el mismo tiempo de retención.
Con el propósito de determinar la estructura de este compuesto mayoritario en la fracción E4 se llevaron a cabo experimentos de Resonancia Magnética Nuclear de Protón (RMN-1H) y de
Espectrometría de Masas (EM).
El espectro de RMN1H, Figura 12 del anexo, presenta señales
características de protones olefínicos que corresponden a un resto metilen (CH2=) a 5,3 ppm con acoplamiento geminal de 1,08 Hz. Hay
ausencia de otros tipos de acoplamiento por lo que este radical debe estar unido a un carbono cuaternario. Entre 0,70 y 0,9 ppm se observan desplazamientos correspondiente a grupos metilos (CH3-) en forma de
singletes. Aparecen señales múltiples entre 0,9 y 1,3 ppm que corresponden a restos de radicales alifáticos del tipo metilenicos (CH2) y
metílicos (CH) que acoplan entre sì. No hay señales importantes en la zona aromática que se relacione con los desplazamientos descritos. Por lo que estas corresponden a un producto natural del tipo terpenoide.
El Espectro de masas, figura 10 del anexo, presenta un ión molecular M+ m/z 220 que corresponde a la fórmula molecular C
15H24O
cuyo número de insaturaciones es de 4. El número de carbonos permitió
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determinar que se trataba de un sesquiterpeno azulenogénico que fue confirmado por las fragmentaciones características que se pueden observar en la Figura 14
Una de estas fragmentaciones (a) involucra la pérdida del anillo de ciclopentano junto con un átomo de hidrógeno, el ión formado tiene un m/z 147 (31%). La pérdida de CH3 da origen al fragmento m/z 205
(48%), luego la pérdida de H2O origina un m/z 187 (19%), sucesivas
desmetilaciones y transferencias de hidrógenos origina los iones m/z 173 (20%) y m/z 159 (41%).
La ruptura (b) es una ruptura alílica que confirma al grupo metilen en el segundo anillo, m/z 138, la posterior pérdida de H2O y CH3
evidencia la presencia de estos en el anillo de ciclopentano. La pérdida de C5H8 y la formación del iòn m/z 150 y posterior desmetilación y
deshidratación origina el fragmento m/z 119 (59%).
Las fragmentaciones en su EM indicadas en el esquema nos llevan a proponer al compuesto S-1, el sesquiterpeno (1 R,S,
4 ,7 ,7 )-Decahidro-1,1,7-trimetil-4-metilen-1H-ciclopro[e]azulen-7- -ol.
La comparación con los datos bibliográficos confirman que se trata del sesquiterpeno de nombre vulgar Espatulenol.16
La evaluación del efecto hipoglucemiante estuvo orientada a determinar la dosis adecuada de extracto CHCl3 para controlar el
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aumento del nivel de glucosa en la prueba de tolerancia que sucede después de los 150 minutos de haber suministrado la glucosa.
Observando los promedios para cada tiempo de observación del grupo total de los 20 sujetos hay una tendencia creciente en el índice de tolerancia a la glucosa hasta los 120 minutos luego de lo cual se produce una disminución. Esto se presenta para el grupo experimental a los 60 minutos y luego hay una tendencia a disminuir.
Los grupos de sujetos asignados a cada tratamiento (7,7,6) muestran el patrón general en el índice de tolerancia a la glucosa, pero con diferentes valores (127,3 ; 106,9 ; 138,2). También el grupo experimental muestra el patrón general 108,1 y 124,6 a los 60 minutos para los tratamientos 1 y 2 ;respectivamente en el tratamiento 3 el punto máximo se presenta a los 90 minutos con 137,8
Los tres tratamientos aceleran el índice de tolerancia a la glucosa en sangre y esto está en relación con la dosis empleada ( a mayor dosis menor tiempo de absorción)
Del análisis de varianza se puede ver que La suma de cuadrados total (96 632.64 ) se descompone en 5 componentes: correspondiente a las ocasiones de observación, a los tratamientos, a la interacción de ocasiones por tratamientos, a la corresponde a sujetos experimentales y al error experimental. En el cuadro 11 se puede observar:
1) Que la razón F observada para ocasiones (25,36) es mayor que el valor tabular correspondiente (F0,05, 4, 68 = 2,507) esto nos indica que hay evidencia empírica suficiente para rechazar la hipótesis Ho : media de las ocasiones son iguales.
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2) Que la razón F observada para tratamientos (42,48) es mayor que el valor tabular correspondiente (F0,05, 2 , 68 = 3,132) esto nos indica que hay evidencia empírica suficiente para rechazar la hipótesis Ho : la media de los tratamientos son iguales.
3) Que la razón F observada para la interacción de ocasiones por tratamiento (1,04) es menor que el valor tabular correspondiente (F0,05, 8, 68 = 2,078) esto nos indica que no hay evidencia empírica suficiente para rechazar la hipótesis Ho : la media de los tratamientos a lo largo de las ocasiones son iguales.
4) Que la razón F observada para sujetos (4,62) es mayor que el valor tabular correspondiente (F0,05, 17, 68 = 1,775) esto nos indica que hay evidencia empírica suficiente para rechazar la hipótesis Ho : la media de los sujetos son iguales.
Aceptar la hipótesis nula de interacción nos indica que estos perfiles son paralelos, Figura 7.Rechazar la hipótesis de igualdad de tratamientos nos indica que hay, al menos, un tratamiento que es significativamente diferente de los demás, queda por identificar cual podría ser este tratamiento.
Para identificar el tratamiento que muestra mejor efecto de reducción de glucosa en sangre, se han calculado para cada sujeto experimental la pendiente del índice de glucosa en sangre observados en los tiempos 60, 90, 120 y 150 minutos, con la finalidad de tener un único indicador de estas cuatro observaciones.
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Con los valores mostrados en el cuadro 12 se ha evaluado las significancia de la Ho: μ(Trat 1) – μ(Trat 3) = 0 ,usando una prueba t – Student con 11 grados de libertad. El valor t observado(-2,94) es significativo (debido a que el valor p calculado para este evento es menor que 0,05. Se obtiene el mismo resultado para el contraste de la Ho: μ(Trat 2) – μ(Trat 3) = 0 .Esto nos permite afirmar que la dosis menor es significativamente diferente de las otras dos dosis
Con la dosis 0,0675mg/kg no existió una disminución significativa del nivel de glucosa, más si con la dosis 0,257mg/kg, los resultados demuestran que esta concentración modifica la absorción de glucosa, siendo mas notorio a los 120 minutos donde esta el pico de glicemia en ratas normales y desciende con la dosis hasta 76,71 mg/mL no lográndose este efecto con las otras dosis, la segunda fue 87,57mg/mL y la tercera de 117,16mg/mL lo que demostró que la dosis efectiva es la de 0,257mg/kg. La concentración de valor media corresponde a la usada por humanos.
La fracción FCF2 es la que presenta la acción hipoglucimiante y los principios activos encontrados en esta fracción corresponden a ácidos grasos, sesquiterpenos y triterpenos (E1- E6), también se han identificado flavonoides, compuestos fenólicos y taninos a los cuales se les atribuye la actividad farmacológica evaluada para esta planta.
La evaluación de la actividad antibacterial estuvo orientada a determinar el efecto del extracto ante la presencia de las bacterias
Echerichia Coli y Etaphylococcus aureus comparado con Amikacina
como patrón de referencia, La Amikacina fue utilizado por ser el único
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antibiótico disponible con eficacia contra la Escherichia coli, y Staphylococcus aureus. Este patrón mostró una zona de al menos 7
mm de halo después de 24 h de exposición en todos los ensayos.
Especies de plantas que presenten como mínimo 7 mm , se consideran antibacterialmente activos.15 El halo mostrado con la fracción
FCF2 es de 12 mm y del extracto clorofórmico puro fue de 8 mm, por lo que se puede afirmar que tienen actividad antibacterial frente a
Staphylococcus aureus. No se mostró actividad con la bacteria Escherichia coli.
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V.
CONCLUSIONES
1. La Myrcianthes myrsinoides (HBK).Grifo tiene como metabolitos
secundarios, flavonoides, compuestos fenólicos, esteroides, taninos y compuestos terpenoidales.
2. La fracción FCF2 presentó actividad hipoglucemiante en ratas blancas Holztein ( 200 g de peso promedio) en tres dosis 0,0675 mg/kg , 0,133 mg/ kg y 0,257 mg/kg; siendo el más significativo la dosis 0,257 mg/kg
3. La fracción FCF2 presento actividad antibacterial frente a Staphylococcus aureus, mostrando un halo de 12mm, siendo mayor respecto al patrón( 7mm)
4. De la fracción E4 de la Myrcianthes myrsinoides (HBK).Grifo ha
sido identificado el sesquiterpeno (1 R,S, 4 ,7 ,7 )-
Decahidro-1,1,7-trimetil-4-metilen-1H-ciclopro(e)azulen-7- -ol. S- 1, de nombre vulgar Espatulenol, como componente mayoritario. 5. De las otras fracciones fueron identificados los compuestos Trans-
12,13-epoxiestearato de metilo, Espatulenol, Metil cromate
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VI. RECOMENDACIONES
1. Continuar el estudio fitoquímico de la Myrcianthes myrsinoides (HBK).Grifo en las fracciones no estudiadas
2. Se recomienda realizar estudios posteriores para evaluar el efecto Hipoglucemiante en ratas diabéticas.
3. Obtener mayor cantidad de los compuestos identificados para determinar el responsable directo de la actividad.
4. Se recomienda el uso de la rumilanche, como infusión para mantener el nivel de glucosa en la sangre en niveles bajos y recomendados.
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VII. BIBLIOGRAFIA
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