• Para el agar inclinado extracto de levadura (YE), este se debe inclinar el agar e
incubar a 42°C, ya que otras especies de Pseudomonas pueden crecer
ligeramente a 42°C en los medios antes en la pre-incubación
Procedimiento para bioquímicas
• A partir de cada resultado positivo en agar TSI, inocular por duplicado en agar inclinado de extracto de levadura (YE), en caldo de Koser citrato, caldo de malonato, medio basal que contenga arginina descarboxilasa, agar nitrato de la motilidad, la gelatina de nutrientes (CDC), F agar Pseudomonas, y Pseudomonas
Agar P.
Procedimiento para agar inclinado extracto de levadura (YE):
• Inocular por duplicado, uno de ellos se incuba a 35 ° C durante 24 ± 2 h, y el otro a 42 ° C durante 24 ± 2 h.
Resultados
• Pocas Pseudomonas spp., diferente de P. aeruginosa podrán crecer 42°C; que además produce un olor a pescado, en trimetilamina o en agar YE.
• Aproximadamente el 4% de todas las cepas que se encuentran habitualmente no producen pigmento. Confundiéndose con Alcaligenes spp., Achromobacter spp.,
entre otras especies no pigmentadas, por tal razón debe probarse antes de ser descartadas las bioquímicas analizadas de la muestra.
Procedimiento para Caldo citrato Koser’s:
• Inocular el caldo e incubar a 35 °C durante 24 y 48 h. utilizar citrato como indicador de turbidez.
Procedimiento para caldo malonato:
• Inocular el caldo malonato. Incubar a 35 °C durante 24 ± 2 h.
Resultados
• Una prueba positiva que indica el uso del malonato como única fuente de carbono, se determina mediante el cambio de color del indicador de verde a azul (alcalino).
Procedimiento para agar nitrato motilidad:
• Para inocular haga una punción recta, en dirección vertical desde la superficie hasta la profundidad. Incubar a 35 °C durante 24 ± 2 h. Añadir unas gotas de ácido sulfanílico y naftilamina.
Resultados
• Un resultado de color rosa oscuro o rojo indica la reducción de nitrato a nitrito. Un color negativo junto con la presencia de burbujas de gas o grietas en el medio se considera una reacción positiva e indica la reducción de nitrato a nitrito a nitrógeno libre. (NOTA: Se debe comprobar siempre que el tubo de control se incubó bajo las mismas condiciones.)
• Inocular en el medio. Asegure la tapa de rosca para evitar la aireación. Incubar a 35 °C durante 24 ± 2 h. Examinar el crecimiento.
Resultados
• Una reacción positiva para la descarboxilación de arginina, se determina por el cambio en el color del medio a púrpura. Una reacción negativa se indica mediante un cambio de color amarillo (ácido).
Procedimiento para licuefacción de la gelatina:
• Inocular los tubos de gelatina por punción e incubar a 25 ° C durante al menos 72 h. Enfriar antes de examinar la licuefacción.
• Incubar los tubos negativos 1 semana, estos se mantienen normalmente hasta 6 semanas antes de desecharlos, pero claramente esto no es práctico.
Resultados
• P. aeruginosa por lo general se licua la gelatina con rapidez.
Primera fase del procedimiento para agar Pseudomonas F y agar Pseudomonas P:
• Inocular las placas de agar Pseudomonas F y P. Incubar a 25 ° C durante al menos 3 días.
• Romper con una varilla de vidrio el agar P agar; y agregar una cantidad aproximadamente igual de agua destilada y agitar vigorosamente hasta que el agua ha eliminado como pigmento tanto como sea posible.
• Decantar en el separador.
• En una campana de química, añadir cloroformo 5-10 ml de agua en el separador y agitar.
• El azul piocianina migrará al cloroformo.
• Extraer una capa de cloroformo en un tubo de ensayo. • Añadir alrededor de 3 ml de agua destilada.
• Añadir 1 gota 1 N de H2SO4. La piocianina se pone roja y migra al agua. Deseche
Resultados
• Examinar el agar F con luz negra (UV de onda larga). Los pigmentos Fluorescentes solubles en agua (pioverdines) se difundirá en agar si este en el aislamiento contiene Pseudomonas spp.
Procedimiento tinción de flagelos:
Observaciones
• Si la cepa reúne los requisitos de P. aeruginosa, incluyendo los pigmentos, la tinción de los flagelos no se hace necesario.
Procedimiento
• En el caso de hacer la tinción se recomienda utilizar los métodos Clark o los siguientes métodos por ejemplo, Leifson o Bailey. O un método de rápido montaje húmedo, como es la tinción Ryu.
Resultados
• Se ha reportado que P. aeruginosa tiene un flagelo polar único. Otras especies de
Pseudomonas fluorescentes, tienen varios flagelos. Resultados de las bioquímicas
TSI
Ácido extremo, alcalino inclinación + gas - Negativo P. aeruginosa
Ácido extremo, ácido inclinación + gas - Negativo P. aeruginosa
Alcalino extreme, ácido inclinación + gas - Probablemente P. aeruginosa
Agar YE
No crecimiento a 42°C - Negative P.aeruginosa
Crecimiento a 42°C - Probablemente P. aeruginosa
Arginina descarboxilasa
Negativo - Probablemente no es P. aeruginosa
Positivo - Probablemente no es P. aeruginosa
Citrato Koser’s
No crecimiento - Probablemente no es P. aeruginosa
Crecimiento - Probablemente P. aeruginosa
Utilización de malonato
Positivo - Probablemente P. aeruginosa Reducción del nitrato
Negativo, no gas - Probablemente no es P. aeruginosa
Positivo - Probablemente P. aeruginosa
Motilidad
Negativo - Probablemente no es P. aeruginosa
Positivo - Probablemente P. aeruginosa
Flagelación
Flagelo polar - Probablemente P. aeruginosa
Algunos otros flagelos - Probablemente no es P. aeruginosa
Agar Pseudomonas F
No pigmento fluorescente - Negativo P. aeruginosa
Pigmento soluble en agua (pioverdina) - P. aeruginosa
Agar Pseudomonas P
No pigmento - Negativo P. aeruginosa
Si el pigmento es presente, confirmar procianine.
- P. aeruginosa
METODO PARA LA EVALUACION DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS (solo para talcos y polvos)
Observaciones
• Pre-reducir las cajas de agar anaerobias antes de la inoculación, colocándolas en una atmósfera anaerobia durante la noche (12-16 h). Incubar las placas de agar anaerobias en la atmósfera anaeróbica (recipiente de anaerobios, incubadora, o en la cámara) durante 2 días a 35 ± 2 ° C; Incubar las placas aeróbicamente MLA durante 2 días a 35 ± 2 ° C como el control de aeróbica.
• Los anaerobios estrictos que sólo crecen en los frascos de anaerobios. Se recomienda que una pequeña cantidad (0,1 ml) de inóculo, para sembrar sobre el medio disminuir el tiempo en expandir la muestra, este procedimiento se realizara en cámara anaerobia para disminuir la exposición al oxigeno.
Procedimiento
• Realizar el procedimiento como se describió anteriormente para microorganismos aerobios mesofilos.
• Agar anaerobio (MLA) pre-reducido, y 5% de agar sangre desfibrinada de oveja • Incubar las placas de agar sangre en atmósfera de dióxido de carbono (10.5%
frasco de vela o incubadora de CO2), y las cajas de agar anaerobio en frascos de
• Incubar durante 48 horas.
• Reincubar durante 2 días más si no aparecen colonias a las 48 h.
• Compruebe si hay esporas germinales sembrando en caldo de carne cocida, incubándose a 35 °C durante 2 días. El uso la tinción de esporas es obligatoria.
Interpretación de los resultados
De los productos cosméticos no se espera que estos sean asépticos, sin embargo, deben estar completamente libre de patógenos microbianos de alta virulencia.
De tal manera que la presencia de patógenos (Pseudomonas aeruginosa, Candida
albican y Staphylococcus aureus) y microrganismos oportunistas, es inaceptable en cosméticos, en especial para aquellos usados en la zona de los ojos.