3.3 Structure of fuzzy rule based classifiers
3.3.1 Knowledge base learning approaches
Investigaciones previas han determinado la importancia del dominio C-terminal de FimH para su ensamblaje en la fimbria. La estructura del cristal de FimC- FimH muestra que existe una amplia interacción entre la chaperona FimC y el dominio C-terminal de FimH (Choudhury et al., 1999). El complejo formado por C-FimH/FimC se une al dominio periplásmico N-terminal de FimD (FimDN) in
vitro (Nishiyama et al., 2003). Recientemente, la resolución del cristal del complejo ternario formado por FimDN/C-FimH/FimC muestra interacciones
específicas entre C-FimH/FimC y FimDN que muestran que el usher es capaz
de discriminar entre FimC libre o unida a un dominio pilina (Nishiyama et al., 2005). Datos previos a nuestro trabajo también indicaban que los dos dominios de FimH, N y C terminales, cuando se expresan de forma independiente en el periplasma se recuperan junto a FimD6xhis (Barnhart et al.,
2003). Aunque este experimento indica una interacción física entre el dominio N-terminal de FimH y FimD, su importancia biológica para el ensamblaje de la fimbria no se había establecido. Nuestros resultados muestran la importancia
biológica de esta interacción entre el dominio N-terminal de FimH y FimD para la incorporación de FimH en la fimbria.
Un aspecto importante es el sitio/s específico de FimD implicado/s en la interacción con el dominio N-terminal de FimH. FimD es una proteína de gran tamaño (833 aminoácidos) que reconoce los complejos binarios dominio pilina- FimC en el periplasma y que media la translocación de las subunidades estructurales tipo pilina a través de la ME (Saulino et al., 2000). FimD además cataliza la formación de fibras facilitando las interacciones entre las subunidades pilina aceptora y donadora durante la reacción de intercambio de hojas β (Vetsch et al., 2006). Por analogía al usher PapC, se piensa que FimD contiene un canal hidrofílico de 2-3 nm a través del cual los dominios pilina plegados se translocan (Li et al., 2004; Saulino et al., 2000; Thanassi et al., 1998b). FimD posee tres dominios proteicos diferentes; un dominio N-terminal periplásmico, un dominio central insertado en la ME y un dominio periplásmico C-terminal. El dominio N-terminal periplásmico (FimDN) es soluble y
comprende los residuos 1-135. Este dominio ha demostrado ser el sitio inicial para el reconocimiento de los complejos binaros pilina-FimC (Ng et al., 2004; Nishiyama et al., 2003; Nishiyama et al., 2005). Datos estructurales y bioquímicos indican que el dominio FimDN no une el dominio N-FimH
(Nishiyama et al., 2003; Nishiyama et al., 2005). De acuerdo con nuestros resultados deben existir regiones diferentes al dominio FimDN que
interaccionen con el dominio N-FimH. La predicción estructural del dominio central de FimD muestra que está compuesto por hojas β anfipáticas (~20-26), insertadas en la ME formando un barril β con un canal hidrofílico central (Henderson et al., 2004; Koebnik et al., 2000). Además, los últimos 150 aminoácidos de FimD podrían formar un segundo dominio periplásmico soluble que parece participar como un segundo sitio en el reconocimiento del complejo pilina-FimC y en los siguientes pasos del ensamblaje de fimbrias (So y Thanassi, 2006; Thanassi et al., 2002). Debido a la forma en L de la proteína FimH se ha sugerido que el dominio N-terminal de FimH podría insertarse en el canal hidrofílico de FimD (Barnhart et al., 2003) donde el dominio pilina unido a
FimC contactaría con los dominios periplásmicos de FimD. Esta hipótesis es compatible con nuestros resultados, de acuerdo a los cuales proponemos un modelo de interacción de FimH con el usher FimD en el que mientras el dominio C-FimH en complejo con la chaperona FimC estaría interaccionando con el dominio FimDN, el dominio N-FimH a través de bucles expuestos en su
superficie contactaría con regiones adicionales de FimD induciendo además la activación de FimD en la que estarían implicados determinados residuos de la zona 2 de N-FimH, que activaría la polimerización de la fimbria. Este modelo se resume en la Figura 47.
FIGURA 47. Modelo de ensamblaje de FimH en fimbrias tipo 1. El usher FimD contiene sitios N-terminal
(N) y C-terminal (C) para la interacción con los complejos chaperona-subunidad. La interacción del complejo C-FimH/FimC se produce en el dominio N-terminal de FimD mientras que la interacción de N- FimH se produce en una región diferente de FimD. Esta interacción es necesaria para producir la activación de FimD.
1. Hemos desarrollado un sistema de expresión de fimbrias tipo 1 en E. coli compatible con phage display en el que el dominio N-terminal de FimH puede ser reemplazado por variantes recombinantes o por dominios tipo Ig. Este sistema de expresión ha sido validado mediante ensayos de agregación de células de levadura, hemaglutinación, purificación de fimbrias, Western blot y ELISA.
2. El dominio N-FimH puede ser presentado en la cápsida del bacteriófago M13 de forma funcional.
3. Existen regiones permisivas a la mutagénesis dentro del dominio N- FimH que toleran modificaciones en su secuencia. La secuencia de N- FimH fue aleatorizada mediante mutagénesis dirigida para la construcción de una genoteca de ~7x108 clones de adhesinas
recombinantes presentadas en la cápsida del bacteriófago M13. Algunas de las adhesinas recombinantes generadas presentan capacidad de translocación y ensamblaje en la fimbria.
4. Variantes quiméricas de FimH en las que el dominio N-FimH fue delecionado o reemplazado por dominios Ig heterólogos no se asociaron a FimD in vivo y consiguientemente no se ensamblaron en la fimbria. Por el contrario, variantes quiméricas de FimH en que un dominio Ig se fusionó a la proteína FimH completa se unieron a FimD in vivo y se ensamblaron en la fimbria aunque a niveles reducidos respecto a FimH silvestre.
5. El dominio N-terminal de FimH es fundamental para la translocación de FimH a través de la membrana externa y su posterior ensamblaje en la fimbria. Esta función depende de la interacción de N-FimH con FimD y de la posterior activación de éste.
6. Los residuos implicados en la interacción de FimH con el usher FimD y en la activación de éste se localizan en bucles expuestos en la superficie del dominio N-FimH cerca del bolsillo de unión a D-manosa y están conservados entre diferentes especies de E. coli. Los residuos G14, G15 y G16 participan en la interacción de N-FimH con FimD mientras que los residuos H45, N46 y D47 participan en la activación de éste.
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