Un estudio preliminar microscópico de las soluciones se realizó para confirmar que el efecto de la organización de las soluciones de gelatina puede ser transferido a la estructura de los materiales preparados a partir de ellas; las diferentes soluciones de gelatina, gelatina-Ca2+, gelatina-HA fueron congeladas y luego liofilizadas. Esta técnica no requiere químicos adicionales, dependiendo únicamente del hecho que el agua presente en la solución/hidrogel forme cristales de hielo que luego puedan ser separados del polímero por sublimación, dando origen a una microarquitectura particular. La dirección de crecimiento y tamaño de los cristales de hielo son función del gradiente de temperatura y las propiedades de la solución del polímero [38]. Manteniendo constante el gradiente de temperatura, la estructura adquirida por las muestras fue considerada solo dependiente de las propiedades de la solución. El efecto de la concentración de gelatina y aditivos en la morfología de los andamios fue estudiado. Secciones longitudinales y transversales fueron obtenidas y analizadas con microscopía óptica, resultados que se presentan en la Figura 4.9.
Figura 4.9 Micrografías ópticas de andamios gelatina (GEL), gelatina-calcio (GEL-Ca2+), y gelatina-HA (GEL-HA) en secciones longitudinales. Magnificación 10X. Ca2+ = 50 mg. HA = 50 mg.
Capítulo 4: Estudio de la organización y evolución de soluciones de gelatina en presencia de nanorodillos de HA
Secciones transversales y verticales de las muestras son análogas mostrando homogeneidad en la disolución. En las redes de gelatina pura, los poros, que son resultado de los arreglos de conexión de la gelatina, tienen forma circular y están distribuidos aleatoriamente; mientras que en los materiales con Ca2+ e HA se observan elongados y con una distribución regular en ciertas áreas. La porosidad de los andamios de gelatina se incrementó casi linealmente con el decrecimiento de la concentración de la proteína. Esto fue atribuido al efecto de los entrecruzamientos de la gelatina sobre el crecimiento de los cristales de hielo durante el congelamiento. En la solución de gelatina, las moléculas de agua están separadas por las macromoléculas de gelatina que evitan su acumulación y organización durante el congelamiento. Cuando la concentración de la gelatina se incrementa, como fue discutido en las secciones anteriores, las viscosidades de las soluciones aumentan.
El crecimiento de los cristales de hielo se encuentra restringido debido a las conexiones de las cadenas de gelatina. Finalmente, los cristales de hielo se comportaron como un molde y su forma se ve reflejada en los andamios porosos de gelatina luego del tratamiento de sublimado. Como resultado, los pequeños cristales de hielo se hicieron más finos, y la porosidad se redujo. Un efecto similar se produce cuando los cristales de HA o los iones de calcio se añaden a la solución. En las muestras obtenidas a partir de soluciones GEL-Ca2+ se observa una estructura con menores entrecruzamientos y mayor porosidad. Esto concuerda con los resultados previamente discutidos que muestran que la presencia de iones Ca2+ perturba la agregación de cadenas proteicas. En las imágenes de los materiales preparados a partir de las soluciones GEL-HA fue posible apreciar un patrón repetitivo de áreas de alta densidad. Estos son consistentes con la auto-agregación de cadenas proteicas alrededor de los nanorodillos de HA y la formación de clusters en la solución. Los resultados obtenidos sugirieron que el tamaño de poro y la forma de los andamios de gelatina pueden ser ajustados controlando la concentración de gelatina y los agregados durante su preparación. Al mismo tiempo, sugieren que la asociación de proteínas no solo ocurre durante la formación de los cristales de hidroxiapatita sino que sería influenciada por ellos una vez formados.
4.4 Conclusiones
Los datos de viscosidad intrínseca sumados a la información obtenida a partir de técnicas espectroscópicas permitieron analizar con profundidad la evolución hidrodinámica y las interacciones de cadenas poliméricas de gelatina bajo la influencia de nano cristales de hidroxiapatita en solución acuosas. Se determinó que la fase continua de las soluciones estudiadas, la solución buffer, está en equilibrio dinámico con las macromoléculas dispersas
Capítulo 4: Estudio de la organización y evolución de soluciones de gelatina en presencia de nanorodillos de HA
de gelatina constituyendo un ensamblado de unidades físicamente interconectadas, que se mantienen unidas gracias a uniones intra e intermoleculares. La estructura del agua de las soluciones sufre cambios significativos a medida que el sistema es alterado por la incorporación de los nanorodillos de HA, afectando también todo el ambiente hidrodinámico de las redes proteicas y sus características teniendo, en consecuencia, seria influencia sobre la estructura del andamio definitivo.
A partir de los resultados de esta sección de nuestro trabajo, se realizó la selección de las concentraciones más adecuadas, a nuestra consideración, de gelatina y cristales de HA para la construcción del andamio. La elección se llevó a cabo mediante la observación de factores como el efecto de los cristales sobre la forma de los poros, seleccionándose aquellos con forma elongada y orden en diferentes regiones; el efecto de la concentración de proteína en la porosidad, la pobre consistencia de las estructuras de bajas concentraciones y la facultad de los cristales de actuar como nucleadores de cadenas proteicas. Considerando todos los puntos mencionados llegamos a la conclusión de que la mejor opción para la continuación de nuestros estudios en busca de un entrecruzamiento efectivo en la matriz de gelatina y para la obtención de un marco de poros orientados uniaxialmente es el material conformado a partir de 0,08 g mL-1 de gelatina y 30 mg de cristales de HA por cada 35 mL de solución.
Referencias bibliográficas
[1] J. Y. Rho, L. Kuhn-Spearing, & P. Zioupos, “Mechanical properties and the hierarchical structure of bone,” Med. Eng. Phys., vol. 20, pp. 92–102, 1998.
[2] Y. H. An & R. A. Draughn, Mechanical testing of bone and the bone implant interface. Y. H. An & R. A. Draughn, Eds, Boca Raton, FL: CRC Press, 2000.
[3] W. J. Landis, K. J. Hodgens, M. J. Song, J. Arena, S. Kiyonaga, M. Marko, C. Owen, & B. F. McEwen, “Mineralization of collagen may occur on fibril surfaces: evidence from conventional and high-voltage electron microscopy and three-dimensional imaging.,” J. Struct. Biol., vol. 117, pp. 24–35, 1996.
[4] D. Magne, P. Weiss, J. Bouler, O. Laboux, & G. U. Y. Daculsi, “Study of the Maturation of the Organic (Type I Collagen) and Mineral (Nonstoichiometric Apatite) Constituents of a Calcified Tissue (Dentin) as a Function of Location : A Fourier Transform Infrared Microspectroscopic Investigation,” J. Bone Miner. Res., vol. 16, pp. 750–757, 2001.
[5] J. An, S. Leeuwenburgh, J. Wolke, & J. Jansen, “Mineralization processes in hard tissue: Bone,” en Biomineralisation and biomaterials: Fundamentals and Applications,
Capítulo 4: Estudio de la organización y evolución de soluciones de gelatina en presencia de nanorodillos de HA
C. Aparicio & M. P. Ginebra, Eds, Amsterdam: Elsevier, 2016.
[6] M. J. Olszta, X. Cheng, S. S. Jee, R. Kumar, Y. Y. Kim, M. J. Kaufman, E. P. Douglas, & L. B. Gower, “Bone structure and formation: A new perspective,” Mater. Sci. Eng. R Reports, vol. 58, pp. 77–116, 2007.
[7] N. Hassan, A. Soltero, D. Pozzo, P. V. Messina, & J. M. Ruso, “Bioinspired templates for the synthesis of silica nanostructures,” Soft Matter, vol. 8, no. 37, pp. 9553-9562, 2012.
[8] P. V. Messina, N. Hassan, A. Soltero, & J. M. Ruso, “Identifying emerging trends of protein hydrogels for biological scaffolding,” RSC Adv., vol. 3, pp. 24256–24265, 2013.
[9] S. Deville, E. Saiz, & A. P. Tomsia, “Freeze casting of hydroxyapatite scaffolds for bone tissue engineering,” Biomaterials, vol. 27, pp. 5480–5489, 2006.
[10] H. W. Kim, H. E. Kim, & V. Salih, “Stimulation of osteoblast responses to biomimetic nanocomposites of gelatin-hydroxyapatite for tissue engineering scaffolds,”
Biomaterials, vol. 26, pp. 5221–5230, 2005.
[11] E. Landi, F. Valentini, & A. Tampieri, “Porous hydroxyapatite/gelatine scaffolds with ice-designed channel-like porosity for biomedical applications,” Acta Biomater., vol. 4, pp. 1620–1626, 2008.
[12] S. Peng & C. Wu, “Comparison of the Ca2+/COO- complexation induced controllable aggregation of P(VCL-co-NaA) spherical microgels and linear chains,” Macromol., vol. 34, pp. 6795–6801, 2001.
[13] S. Peng & C. Wu, “Ca2+-induced complexation between thermally sensitive spherical poly(N-vinyl-caprolactam-co-sodium acrylate) microgels and linear gelatin chains in water,” Polymer, vol. 42, pp. 7343–7347, 2001.
[14] W. Lin, Y. Zhou, Y. Zhao, Q. Zhu, & C. Wu, “Cr3+/COO- complexation induced aggregation of gelatin in dilute solution,” Macromolecules, vol. 35, pp. 7407–7413, 2002.
[15] T. R. Keenan, “Gelatin,” Polym. Sci. A Compr. Ref., vol 10, pp. 237–247, 2012.
[16] Y. Li & R. Cheng, “Viscometric study of gelatin in dilute aqueous solutions,” J. Polym. Sci. Part B Polym. Phys., vol. 44, pp. 1804–1812, 2006.
[17] J. Liu, M. D. Nguyen, J. D. Andya & S. J. Shire, “Reversible self-association increases the viscosity of a concentrated monoclonal antibody in aqueous solution,” J Pharm Sci, vol. 95, pp. 234–235, 2006.
Capítulo 4: Estudio de la organización y evolución de soluciones de gelatina en presencia de nanorodillos de HA
polyelectrolyte solutions,” Polymer, vol. 43, pp. 1295–1300, 2001.
[19] W. D. Lansing, “The Molecular Weights Of Cellulose And Cellulose Derivatives,” J Phys. Chem., vol. 39, pp. 153–168, 1934.
[20] G. V. Schulz & F. Blaschke, “Eine Gleichung zur Berechnung der Viscositätszahl für sehr kleine Konzentrationen, [Molekulargewichtsbestimmungen an makromolekularen Stoffen, IX],” J. für Prakt. Chemie, vol. 158, pp. 130–135, 1941.
[21] A. F. Martin, “Toward a referee viscosity method for cellulose,” Tappi, vol. 34, pp. 363–366, 1951.
[22] M. L. Huggins, “The Viscosity of Dilute Solutions of Long-Chain Molecules. IV. Dependence on Concentration,” J. Am. Chem. Soc., vol. 64, pp. 2716–2718, 1942. [23] K. Lewandowska, D. U. Staszewska, & M. Bohdanecký, “Huggins viscosity
coefficient of aqueous solution of poly(vinyl alcohol),” Eur. Polym. J., vol. 37, pp. 25– 32, 2001.
[24] Y. Pan & R. Cheng, “A novel interpretation of concentration dependence of viscosity of dilute polymer solution,” Chin. J. Polym. Sci., vol. 18, pp. 57–67, 2000.
[25] S. E. Harding, “The intrinsic viscosity of biological macromolecules. Progress in measurement, interpretation and application to structure in dilute solution,” Prog. Biophys. Mol. Biol., vol. 68, pp. 207–262, Sep. 1997.
[26] Y. Lu, L. An, & Z.-G. Wang, “Intrinsic Viscosity of Polymers: General Theory Based on a Partially Permeable Sphere Model,” Macromolecules, vol. 46, pp. 5731-5740, 2013.
[27] M. Masuelli, M. Sansone, & D. Aplicada, “Hydrodynamic Properties of Gelatin– Studies from Intrinsic Viscosity Measurements,” Prod. Appl. Biopolym, pp. 85-116, 2012.
[28] K. Nishida, K. Kaji, & T. Kanaya, “Theoretical calculation of reduced viscosity of polyelectrolyte solutions,” Polymer., vol. 42, pp. 8657–8662, 2001.
[29] H. G. Barth & J. W. Mays, “Modern Methods of Polymer Characterization,” H. G.
Barth & J. W. Mays, Eds, New York: Wiley-Interscience, 1991.
[30] N. Puvvada, P. K. Panigrahi, & A. Pathak, “Room temperature synthesis of highly hemocompatible hydroxyapatite, study of their physical properties and spectroscopic correlation of particle size.,” Nanoscale, vol. 2, pp. 2631–2638, 2010.
[31] N. Vlachy, B. Jagoda-Cwiklik, R. Vácha, D. Touraud, P. Jungwirth, & W. Kunz, “Hofmeister series and specific interactions of charged headgroups with aqueous ions.,” Adv. Colloid Interface Sci., vol. 146, pp. 42–47, 2009.
Capítulo 4: Estudio de la organización y evolución de soluciones de gelatina en presencia de nanorodillos de HA
[32] Y. Zhang & P. S. Cremer, “Interactions between macromolecules and ions: The Hofmeister series,” Curr Opin Chem Biol, vol. 6, pp. 658–663, 2006.
[33] I. M. El-Sherbiny, & H. D. C. Smyth, “Smart Magnetically Responsive Hydrogel Nanoparticles Prepared by a Novel Aerosol-Assisted Method for Biomedical and Drug Delivery Applications.,” J. Nanomater., vol. 2011, pp. 1–13, 2011.
[34] Z. K. Muhidinov, M. L. Fishman, K. K. Avloev, M. T. Norova, A. S. Nasriddinov, & D. K. Khalikov, “Effect of temperature on the intrinsic viscosity and conformation of different pectins,” Polym. Sci. Ser. A, vol. 52, pp. 1257–1263, 2010.
[35] P. V. Messina, G. Prieto, & J. M. Ruso & F. Sarmiento, “Conformational Changes in Human Serum Albumin Induced by Sodium Perfluorooctanoate in Aqueous Solutions,” J. Phys. Chem. B, vol. 109, pp. 15566-15573, 2005.
[36] C. Abrusci, A. Martín-González, A. Del Amo, F. Catalina, P. Bosch, & T. Corrales, “Chemiluminescence study of commercial type-B gelatines,” J. Photochem. Photobiol. A Chem., vol. 163, pp. 537–576, 2004.
[37] K. L. Herrmann, A. D. McCulloch, & J. H. Omens, “Glycated collagen cross-linking alters cardiac mechanics in volume-overload hypertrophy.,” Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., vol. 284, pp. H1277-H1284, 2003.
[38] A. L. Oliveira, L. Sun, H. J. Kim, X. Hu, W. Rice, J. Kluge, R. L. Reis, & D. L. Kaplan, “Aligned silk-based 3-D architectures for contact guidance in tissue engineering,” Acta Biomater., vol. 8, pp. 1530–1542, 2012.
Capítulo 5: Caracterización estructural de andamios de gelatina-nanorodillos de HA (GEL-