CECTa Origen de aislamiento
HinfI (GTG)5 (GAC)5 OPA 2 OPA 3 OPA 7 OPA 8 OPA 9 OPA 10 OPA 11 OPA 15 OPA 16
1230 Miel I A A 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1231 Bombón de sirope de naranja I B A 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1232 Mosto concentrado de uva negra II B A 1 1 1 2 2 1 1 2 1 10132 desconocido III B A 1 2 1 1 2 2 1 1 1 10137 Pasa de Corinto IV B A 1 1 1 2 2 1 1 1 1 10312 Pastel de higo IV B A 1 1 1 2 2 1 1 1 1 10313 Higo seco IV B A 1 1 1 2 2 1 1 1 1 10350 Higo seco V B A 1 7 1 2 2 1 1 1 1 10377 Phoenix dactilifera IV B A 1 1 1 1 2 1 1 1 1 10381 Melaza de caña de azúcar VI E A 1 1 1 1 2 1 1 1 1 10427 Miel IV B A 1 4 1 2 2 1 1 1 1 10445 Mermelada de ciruela fermentada VII B A 1 3 1 2 2 1 1 2 1 10633 Miel VIII B A 1 4 1 2 2 2 1 1 1 11149 bc Uva IX B A 1 7 1 2 2 1 1 2 1 11941 Salsa de soja V C A 2 5 2 3 1 3 2 3 2 11923 Salsa de soja V C A 2 5 2 3 1 3 2 4 2 11930 Salsa de soja V C A 2 5 2 3 1 3 2 4 2 11928 Mosto concentrado de uva II B A 1 2 1 2 2 1 1 1 1 11926 Mosto concentrado de uva II D A 1 6 1 2 2 1 1 2 1 11929 Limonada IV B A 1 1 1 2 2 1 1 1 1 11927 Mosto concentrado de uva II B A 1 2 1 2 2 1 1 2 1 Capítulo 2 101
Capítulo 2
2.2.2. Trazabilidad de cepas de Z. bailii y Z. rouxii en la empresa de frutas confitadas.
Como se ha comentado anteriormente, una vez identificada la especie responsable de la alteración del turrón, interesaba conocer el origen de contaminación por cepas pertenecientes a dicha especie. La importante implicación de las especies Z. bailii y Z.
rouxii en la contaminación de las frutas confitadas, utilizadas en la elaboración de los
turrones, nos llevó a la aplicación de técnicas moleculares que permitieran la diferenciación a nivel de cepa. Teniendo en cuenta estudios previos (Esteve-Zarzoso y col., 2003; Guillamón y col., 1997), y los resultados obtenidos en el apartado anterior con cepas de referencia, se decidió abordar el mismo análisis en las cepas de Z. bailii y Z.
rouxii aisladas de distintos puntos de la cadena de producción de los turrones alterados.
Para ello, según los datos obtenidos en el apartado anterior, se aplicaron las técnicas que habían resultado más resolutivas para la diferenciación de cepas en cada especie,. Así, se aplicó el análisis de restricción del mtDNA con HinfI a ambas especies, y la amplificación mediante RAPD-PCR con OPA 10 y OPA 15, para caracterizar las levaduras de la especie Z. bailii. En el caso de los aislados identificados como Z. rouxii, la técnica de RAPD se realizó con el OPA 3.
Los resultados de este análisis mostraron que el total de 90 cepas de Z. bailii aisladas de las frutas confitadas, jarabes y turrón, compartían un patrón único cuando se aplicaba el análisis de restricción del mtDNA (Figura 9). De la misma forma, se obtuvo un único patrón para los 85 aislados de Z. rouxii analizados (Figura 9).
La técnica de RAPD con OPA 3 evidenció la presencia de dos patrones distintos, A y B, en los aislados de Z. rouxii (Figura 10), mientras que la aplicación de los OPAs 10 y 15 mostró un único patrón en todos los aislados de Z. bailii analizados (Figura 10). Los patrones A y B de RAPD se pudieron observar en cepas de Z. rouxii distribuidas en toda la cadena de producción de las frutas confitadas, tanto en las piezas de fruta como en los jarabes. Por otra parte, la única cepa de Z. bailii (con patrón único obtenido mediante restricción de mtDNA y RAPD con OPA 10 y 15), se encontraba distribuida en diversas muestras de fruta confitada y jarabe en la empresa productora de dichas frutas. Además, la cepa presente en la fruta del turrón alterado mostró este mismo patrón.
Capítulo 2
Figura 9. Ejemplos de patrones de restricción de mtDNA con HinfI que mostraron las cepas de Z. bailii y Z. rouxii, aisladas de las frutas confitadas y de turrones alterados. La línea m corresponde
al marcador de tamaños moleculares: DNA de fago λ digerido con PstI.
Figura 10. Ejemplos de patrones de RAPD que mostraron las cepas de Z. bailii y Z. rouxii aisladas
de frutas confitadas y turrón alterado. La línea m corresponde al marcador de 100 pb.
Z. bailii Z. rouxii m m m m OPA-15 OPA-10 Z. bailii OPA-03 m A B Z. rouxii
Capítulo 2
2.3. Discusión.
Hasta hace poco, la contaminación de los alimentos por levaduras no era considerada como un inconveniente importante en la industria alimentaria. Como consecuencia del aumento considerable en la escala de producción de alimentos y bebidas, de la utilización de tecnologías más modernas de procesado, de la gran variedad de nuevas formulaciones y de la tendencia a reducir el uso de conservantes, la alteración por levaduras se ha convertido en un problema serio para las industrias de alimentos (Loureiro y Querol, 1999; Loureiro y Malfeito-Ferreria, 2003; van der Vossen y Hosfstra, 1996).
La detección y el seguimiento de cepas de levaduras alterantes de forma rutinaria, podría ser de gran utilidad para resolver problemas de contaminación en la industria, y por tanto, evitar pérdidas económicas. El presente trabajo constituye un ejemplo de la aplicación de técnicas moleculares de identificación y caracterización para resolver un problema de alteración por levaduras a nivel industrial. En concreto, la alteración de un turrón de frutas confitadas que tuvo como efectos negativos el abombamiento y rotura de los envases como resultado de la producción de gas por parte de los microorganismos alterantes. En un caso de alteración microbiana, el primer aspecto a tener en cuenta es el referente a la identificación del microorganismo responsable de dicha alteración. Puesto que el turrón objeto de estudio se compone de una mezcla de mazapán y frutas confitadas, fue necesario aislar los microorganismos presentes en ambos ingredientes. En concreto, se aisló una levadura a partir de las muestras de fruta y un hongo filamentoso a partir del mazapán. La levadura fue identificada como Z. bailii por la técnica de análisis de restricción de la región ribosomal 5,8S-ITS, y el hongo filamentoso como N.
mauritiicola mediante la secuenciación de los dominios D1/D2 del gen 26S rRNA. Puesto que N. mauritiicola es un hongo típicamente fitopatógeno, estos datos estaban indicando que nos encontrábamos ante un caso típico de alteración por una levadura, en concreto la especie Z. bailii cuya capacidad fermentativa y habilidad para crecer en alimentos con baja aw y alto contenido de azúcar es bien conocida (Tokuoka, 1993).
Puesto que las frutas contenidas en el turrón procedían de una empresa distinta a la del turrón, procedimos al aislamiento e identificación de las levaduras presentes en la empresa que elaboró dichas frutas, para confirmar la presencia de la especie Z. bailii en dicha emresa. Efectivamente, se identificó la presencia de esta levadura en distintas muestras de jarabe y fruta confitada a lo largo de la cadena de producción de dichas frutas, e incluso en concentraciones muy elevadas en algunos casos.
Capítulo 2