Durante el estudio de expresión y función de las galectinas sobre cultivos de neuronas hipocampales in vitro, incluimos también la Gal-4. En esta ocasión, no observamos ningún efecto relevante sobre los parámetros de diferenciación o crecimiento neurítico (resultados no mostrados), aunque el patrón de expresión de la Gal-4 en las neuronas en cultivo era muy particular.
Teniendo en cuenta la bibliografía que describe la localización de Gal-4 en la membrana apical de las células epiteliales (Braccia et al 2003, Stechly et al 2009), se investigó la posibilidad de encontrar una localización polarizada a nivel de membrana también en las neuronas. Así, se realizaron diferentes experimentos de inmunofluorescencia en neuronas hipocampales de rata, en unos se permeabilizó la membrana como de costumbre, mientras que en otros se incubaron las células con el anticuerpo anti- Gal-4 sin permeabilización previa para limitar la accesibilidad del anticuerpo a la superficie de la membrana de las neuronas.
Estos experimentos mostraron una distribución diferencial de la galectina dependiendo de las condiciones de permeabilización. En células permeabilizadas, la distribución de Gal-4 era más o menos homogénea tanto en el axón como en el dominio somatodendrítico (figura 29A, paneles izquierdos, puntas de flecha y flechas respectivamente), en cambio, las inmunocitoquímicas en las que se prescindió de la permeabilización de membrana revelaron que la presencia de la galectina se limitaba a segmentos discretos de la membrana axonal (figura 29A, paneles derechos, puntas de flecha) quedando excluida del compartimento somatodendrítico. Este resultado sugería que la galectina, al igual que ocurría en células epiteliales, también podría desempeñar un papel específico y relevante en el desarrollo axonal.
Para confirmar la expresión neuronal de Gal-4, se obtuvieron extractos totales de cultivos de neuronas hipocampales y se analizaron por WB utilizando anticuerpo anti-Gal-4. Los resultados corroboraron la expresión de Gal-4 por parte de las neuronas, descartando que los astrocitos residuales, presentes en los cultivos de neuronas de hipocampo (menos del 10% del total del cultivo, Nickel 2003), estuvieran produciendo y liberando al medio extracelular la Gal-4 (figura 29B, panel superior, ET). De hecho, el análisis bioquímico tanto de extractos totales de astrocitos como de medio condicionado proveniente de cultivos de astrocitos corticales, revelaron que Gal-4 no es detectable en éste tipo de
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células (figura 29B, panel central, ET y MC). Para contrastar este dato, se empleó la Gal-1 como control de expresión positivo en astrocitos (figura 29B, panel inferior, ET y MC). Finalmente, mediante inmunofluorescencia tampoco se detectó la presencia de Gal-4 en la glía marcada con GFAP (Glial
Fibrillary Acidic Protein, marcador de astrocitos; figura 29C, paneles superiores), mientras que en el
control con Gal-1 encontramos un fuerte marcaje (figura 29C, paneles inferiores), lo que indica que los astrocitos no expresan Gal-4, o en caso de hacerlo, sería en cantidades no detectables.
Figura 29. Gal-4 es expresada en cultivos de neuronas hipocampales in vitro. A) Neuronas hipocampales
cultivadas durante 72 horas fueron marcadas con anticuerpo anti-Gal-4 (verde), Faloidina conjugada con Texas-red para ver los filamentos de actina (F-actina, rojo) y Hoechst para ver los núcleos (azul). Las inmunocitoquímicas se realizaron bajo condiciones de permeabilización de la membrana con Triton X-100, o sin permeabilizar. La distribución axonal y dendrítica de la galectina viene indicada por puntas de flecha y flechas respectivamente. B) El análisis por WB se realizó con extractos totales (ET) de neuronas hipocampales (NH) y de medio condicionado (MC) de astrocitos (Ast.), empleando anticuerpos anti-Gal-4 y anti-Gal-1. Se usaron también como controles positivos las formas de las galectinas humanas recombinantes rhG4 y rhG1. C) El doble marcaje de astrocitos para Gal-4 y Gal-1 junto al marcador específico de la línea astroglial GFAP, muestra la nula expresión de Gal-4 por parte de los astrocitos. Barras de escala: 25µm.
Estos experimentos produjeron resultados similares en cultivos de neuronas corticales de rata, lo que indicaba que la distribución axonal segmentada de Gal-4 no es una característica exclusiva de las neuronas hipocampales (figura 30A). También se obtuvieron resultados positivos en el análisis bioquímico mediante WB con este tipo de neuronas (figura 30B).
103 Figura 30. Gal-4 es expresada en cultivos de neuronas corticales in vitro. A) Neuronas corticales de 72 hiv
fueron marcadas con anti-Gal-4 (verde), F-actina (rojo) y Hoechst (azul). Las inmunocitoquímicas se realizaron bajo condiciones de permeabilización de la membrana con Triton X-100, o sin permeabilizar. La distribución axonal y dendrítica de la galectina, idéntica a la obtenida para las neuronas hipocampales, viene indicada por puntas de flecha y flechas respectivamente. B) Se realizó un análisis por WB de extractos totales (ET) de neuronas hipocampales (NH) y neuronas corticales (NC) con anticuerpo anti-Gal- 4, y se usó la forma recombinante humana rhG4 como control positivo. Los resultados mostraron que las neuronas corticales también tienen cierto nivel de expresión endógena de Gal-4. Barras de escala: 25µm.
Para confirmar la expresión de la galectina in situ, se realizó un análisis de expresión mediante inmunohistoquímicas dobles en secciones de cerebro de rata adulta, para Gal-4 y para marcadores axonales, Tuj1 para neuronas hipocampales, y NFH (cadenas pesadas de neurofilamentos o
Neurofilament Heavy chain) para neuronas corticales. En concordancia con nuestros resultados in vitro,
Gal-4 se expresa a lo largo de los axones de poblaciones de neuronas hipocampales (figura 31A, flechas) y corticales (figura 31B, flechas).
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Figura 31. Gal-4 es expresada en tejido cerebral adulto in situ. A,B) Se realizaron secciones de cerebro de
rata adulto embebido en parafina, y se realizó un doble marcaje para Gal-4 (verde), los marcadores axonales Tuj1 y NFH para neuronas hipocampales y corticales respectivamente, y Hoechst para marcar los núcleos (azul). Se detectó presencia en tractos axonales tanto en neuronas hipocampales (A) como en neuronas corticales (B). Las zonas enmarcadas se muestran en detalle en los paneles inferiores, en los cuales se puede apreciar la localización de Gal-4 con respecto a los marcadores axonales indicados por las puntas de flecha. C) Se realizó también un control para detectar marcaje inespecífico, utilizando tejido de los mismos animales y empleando el mismo procedimiento pero omitiendo el paso correspondiente al anticuerpo primario. Barras de escala: 25µm.
9. La galectina-4 se localiza en la membrana axonal desde estadíos de desarrollo tempranos, y se