Limitations

Mientras que en el artículo 2 se utilizó una línea celular endotelial humana para determinar los cambios fisiopatológicos, en el artículo 3 se puso a punto un modelo murino de BHE in

vitro a partir de cultivos primarios. Durante los últimos años, muchos de los estudios funcionales en el campo de la β-amiloidosis cerebral se han basado en el transporte del péptido Aβ tanto in vitro como in vivo. En este sentido, en el tercer trabajo de esta tesis, quisimos establecer en nuestro laboratorio un modelo de BHE in vitro murino primario, diseñado y caracterizado por el grupo liderado por el Dr. Cecchelli (Cosine et al., 2006; Ceccheli et al., 2007; Mysiorek et al., 2009), para el estudio del tráfico del péptido Aβ. El principal objetivo de este modelo es mimetizar las características de la BHE in vivo, para desarrollar una herramienta preclínica y evaluar el transporte del péptido Aβ y el impacto de algunas moléculas relevantes descritas hasta la fecha en el campo de la AAC y la EA. Como ya hemos descrito, la importancia de la BHE se basa en la regulación de la permeabilidad de los microvasos de cerebro, y por tanto, el transporte restrictivo de substancias. Hasta la fecha, muchos autores han comparado y cuestionado el origen de los cultivos utilizados para establecer un modelo in vitro de BHE que mimetice la situación en humanos. Durante años, el modelo más utilizado ha sido el bovino, el de rata y posteriormente el de ratón. Este último ha adquirido un gran interés ya que permite el uso de ratones transgénicos para estudios dirigidos a moléculas específicas (Mysiorek et al., 2009). Recientemente, se ha puesto de manifiesto las diferencias génicas entre estas especies y el humano, y es por ello por lo que muchos investigadores han puesto mucho interés en el desarrollo de modelos de BHE in vitro humanos. Éstos se han establecido mediante el cultivo primario de células endoteliales aisladas de tejidos frescos obtenidos por autopsia, o por biopsias de pacientes con tumores o pacientes epilépticos. A pesar de los buenos resultados, existe la limitación de la disponibilidad del material de partida y por ello no se ha podido establecer como modelo de uso universal (Ceccheli et al., 2007). Como alternativa, hay otros estudios que utilizan líneas celulares humanas inmortalizadas, como las células hCMEC/D3. Sin embargo, la inmortalización de estas células da lugar a diferencias en las propiedades específicas de BHE, como una baja resistencia eléctrica (TEER) basal y diferencias en la discontinuidad y nivel expresión de proteínas TJ (Weksler et al., 2005; Eigenmann et al., 2013), lo que se traduce en un aumento de permeabilidad y transporte de pequeñas substancias en este modelo. Por otro lado, cabe destacar el reciente desarrollo de un modelo de BHE basado en células endoteliales a partir de la diferenciación de células madre (Man et al., 2008; Lipmann et al., 2012; Cecchelli et al., 2014), aunque las estrategias para la diferenciación en células endoteliales de BHE aún son objetivo de estudio.

Teniendo en cuenta las ventajas/desventajas y las dificultades del uso del modelo de BHE in vitro humano, nuestra elección fue la puesta a punto de un modelo murino. A pesar de ser

conscientes de las diferencias génicas y biológicas entre ratón y humano, creemos que el modelo primario de ratón mantiene las propiedades de BHE (especificidad del paso de substancias y baja permeabilidad), tiene bajo coste, y, es fácil de diseñar y manipular. A diferencia de otros modelos de BHE como el bovino, el tiempo de cultivo desde el aislamiento endotelial hasta su confluencia para el uso son sólo 5 días, lo que permite que las células mantengan su fenotipo real sin la necesidad de co-cultivar el endotelio con astrocitos o medios condicionados.

Para su puesta a punto, el primer objetivo del artículo 3 fue validar el modelo murino de BHE previamente establecido (Coisne et al., 2005) para evaluar la eliminación de Aβ(1-40) cerebral utilizando un método de determinación fluorimétrica (Zlokovic, 2004; Saint-Pol et al., 2012; Saint-Pol et al., 2013; Bachmeier et al., 2010; Bachmerier et al., 2013). Nuestro modelo refleja el fenotipo propio de BHE, con una expresión continua del marcador endotelial CD31, de la proteína TJ ZO-1 y una baja permeabilidad paracelular. Utilizamos diferentes dosis no tóxicas de Aβ(1-40) fluorescente (de 1-120 nM), para evaluar la cinética de transporte de cerebro a sangre (eflujo) mediado por receptor. Ademαs, utilizamos paralelamente Inulina marcada radioactivamente, debido a que es una molécula de igual tamaño que el péptido soluble Aβ(1- 40) y nos sirve de control negativo de transcitosis no mediada por receptor. Además, para caracterizar nuestro modelo, confirmamos que la eliminación de Aβ(1-40) del compartimento basolateral al apical era principalmente vía LRP, como previamente se había descrito (Deane et al., 2004; Bell et al., 2007; Zlokovic et al., 2004). A nivel de expresión, verificamos que nuestras células endoteliales expresaban el receptor LRP1 y LRP2, dado que en el modelo bovino de BHE extensamente utilizado se ha observado recientemente la ausencia de su expresión endotelial (Candela et al., 2015). A nivel funcional, tras bloquear los receptores LRP1/2 con RAP, obtuvimos una clara reducción en la movilización de Aβ(1-40), por lo que pudimos concluir que la eliminación cerebral β-amiloide se producía principalmente vía LRP.

En resumen, consideramos que el modelaje in vitro de la BHE nos permite hacer predicciones funcionales y de transporte para moléculas implicadas en la fisiopatología del ictus, tanto isquémico cómo hemorrágico. En el caso específico de la AAC y la EA, el marcaje y cuantificación de Aβ mediante fluorescencia da lugar a un método rápido, económico y eficaz para evaluar su paso a través de la BHE.