4. FUNCTIONALITY
4.9 Contact Manager
4.9.3 Discovery Agent Manager
4.9.4.1 Link Functionality Common to all Link Types
Preparación del inóculo Método de desarrollo previo
Seleccione 4 ó 5 colonias bien aisladas de igual morfología de la placa de cultivo.
Prepare una suspensión en 4 ó 5 ml de un caldo apropiado (pej: Tripteina Soja) tocando
la parte superior de cada colonia.
Incube a 35 ºC hasta que este alcance o exceda la turbidez del estandar (2-6 hs).
Ajuste la turbidez del inóculo con solución salina o caldo hasta el tubo 0,5 de la escala
de Mc. Farland, por comparación visual con el estandar. Para ello, mire los tubos contra
un fondo blanco con una línea negra como contraste. Esta suspensión contendrá
aproximadamente 1 a 2 x 10 8 UFC/ml para E.coli ATCC 25922.
Método directo de inoculación a partir de colonia aislada
Como un método alternativo al descripto anteriormente el inóculo puede ser realizado
en solución salina o caldo a partir de colonias seleccionadas de una placa de cultivo no
selectivo de 18 a 24 horas de incubación. Inmediatamente la suspensión debe ser
60 Este método es de elección para microorganismos fastidiosos, ej: Haemophilus spp.,
Streptococcus spp. y Neisseria gonorrhoeae, (ver sección 6.0.) o para Staphylococcus
potencialmente meticilino resistentes.
Inoculación de las placas
Dentro de los 15 minutos después de ajustado el inóculo siembre las placas de M.
Hinton con un hisopo estéril. Presione el hisopo contra las paredes del tubo a fin de
escurrir el exceso de inóculo.
Inocule la superficie seca del M. Hinton por hisopado en tres direcciones para asegurar
una completa distribución del inóculo. Las zonas de inhibición serán uniformemente
circulares y el desarrollo confluente o casi confluente.
Si crecen solo colonias aisladas el antibiograma debe repetirse.
Espere de 3 a 5 minutos, pero no más de 15 min. antes de aplicar los discos para que el
exceso de humedad superficial sea absorbido.
NOTA: Nunca use cultivos over-nigth ni otros inóculos no estandarizados para el
hisopado de las placas. Evitar extremos en la densidad del inóculo.
Aplicación de los discos de ATB en las placas inoculadas
Colocar los discos sobre la superficie del agar inoculada con pinza estéril aplicando una
ligera presión a una distancia no menor a 24 mm desde un centro al otro. Debido a que
algunas drogas difunden casi instantáneamente, un disco no debe ser removido una vez
que tomó contacto con la superficie del agar. No deben colocarse mas de 12 discos por
placa de 150 mm y no mas de 5 discos por placa de 100 mm.
Incubar las placas invertidas a 35 ºC dentro de los 15 minutos posteriores a que los
discos fueron aplicados. Con excepción de Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae y
Streptococcus spp. las placas no deberán ser incubadas en concentración incrementada
61 ambiente y el agregado de CO2 alteraría significativamente el tamaño de las zonas
inhibitorias para algunos agentes antibióticos.
Lectura de las placas e interpretación de resultados
Después de 16 a 18 horas de incubación examine cada placa y mida los diámetros de las
zonas de inhibición. Si las placas fueron satisfactoriamente hisopadas y el inóculo fue el
correcto, las zonas de inhibición serán uniformemente circulares y habrá desarrollo
confluente. Si el microorganismo estudiado es un Staphylococcus spp. o Enterococcus
spp., incube 24 horas para vancomicina y oxacilina, pero los otros antimicrobianos
pueden leerse entre las 16-18 hs. Use luz transmitida para examinar un ligero
crecimiento de cepas meticilino o vancomicina resistentes dentro de las zonas de
inhibición. Cualquier desarrollo dentro de la zona de inhibición es indicativo de
meticilino o vancomicina resistencia.
El punto final deberá tener en cuenta el área que no muestre desarrollo obvio a ojo
desnudo, no incluyendo velo de crecimiento o colonias muy pequeñas que puedan ser
detectadas solo con mucha dificultad en el borde de la zona. Colonias mayores
creciendo dentro de la zona clara deberán ser subcultivadas, reidentificadas y
reensayadas. Algunos Proteus spp. podrían presentar “swarming” dentro de las zonas de
inhibición con algunos antimicrobianos. En estos casos el el velo del “swarming”
debería ser ignorado. En medios suplementados con sangre, se deberá medir la zona de
inhibición del crecimiento, no la zona de inhibición de la hemólisis. Cuando se prueban
discos de trimetoprima/sulfametoxazol pueden arrastrarse sustancias antagónicas que
producen un crecimiento con aspecto de niebla dentro de la zona del halo de inhibición,
en estos casos no considerar en la lectura un crecimiento del 20% o menos del
62
Resultados
Tabla1. Resultados del antibiograma realizado a cepas de Klebsiella pneumoniae.
Correlativo Procedencia Resistencia IPM* Mm CAZ* mm 61 Secreción BLEE 28.7 10 161 Secreción BLEE 26 8 166 Catéter BLEE 25.7 14.3 200 Secreción BLEE 27.3 11 205 Orina BLEE 23.8 15 206 Orina BLEE 25 6 210 Orina BLEE 25.3 11.1 212 Cepa BLEE 29.7 15.3 213 Secreción BLEE 29 6 214 Cepa BLEE 29.5 12.9 216 Secreción BLEE 29 6 218 Catéter BLEE 24.1 10 219 Secreción BLEE 28.1 13 220 Secreción BLEE 28.5 8 251 Secreción BLEE 29.7 12.8 Fuente experimental. mm: milímetros
63
Discusión
El rango de referencia de imipenem es igual o menor a 21 mm, permitiendo
categorizar correctamente este aislamiento como sospechoso de carbapenemasa según
las recomendaciones locales de Argentina (imipenem <=22 mm).
El 100% de las cepas estudiadas según la tabla 1, reportaron zonas de inhibición
de imipenem sensibles lo que las ubica como cepas no sospechosas de carbapenemasas.
Debido a que múltiples mecanismos de resistencia pueden ser responsables de
halos reducidos de este carbapenem (imipenem <=22mm), también se analizó la
capacidad del laboratorio de confirmar el mecanismo de R implicado. Es importante
destacar que en el contexto epidemiológico, es imprescindible que los laboratorios de
microbiología clínica realicen de rutina la confirmación para carbapenemasas indicada
en el algoritmo (sinergias con APB y EDTA/SMA). Tanto la subestimación de este
mecanismo como su sobreestimación (falta de realización de pruebas confirmatorias)
redundan en una mala toma de decisiones clínicas y epidemiológicas para los pacientes
y la Institución.
El fenotipo de carbapenemasa tipo KPC siempre cursa con resistencia a cefalosporinas
de 3ra. y 4ta. generación. Por el contrario, las otras carbapenemasas inhibibles por ac.
borónico (Sme y Nmc-a de Serratia y Enterobacter, respectivamente) en su fenotipo
salvaje cursan con sensibilidad a cefalosporinas de 3ra. y 4ta. generación. Cuando a
estas carbapenemasas se les suma una BLEE, entonces se podría confundir
fenotípicamente con una KPC. Por lo tanto, la confirmación final de la carbapenemasa
involucrada debería realizarse por PCR.
Estos resultados no son confirmatorios ni de gran impacto por la cantidad de muestras
64 salud de la republica de Guatemala, lo cual es muy importante investigar ya que son
muy pocas las opciones terapéuticas restantes al momento de confirmar una alerta.
En algunos casos se puede utilizar aminoglicosidos, fluoroquinolonas, pero estas
familias de antibióticos tienen mayores porcentajes de resistencia en múltiples centros
hospitalarios, por lo tanto en algunas instituciones, las opciones terapéuticas se están
restringiendo fundamentalmente a las polimixinas (colistin), drogas con una alta
toxicidad. Es por ello que es de gran importancia clínica y epidemiológica, la detección,
identificación y reporte de los tipos de carbapenemasas circulantes en cada centro
hospitalario. Solo esto permitirá reconocer cual es la complejidad y magnitud del
problema, ya que nuestras investigaciones revelan que estas enzimas circulan en nuestro
país. Existen ensayos fenotípicos sencillos, que permiten la detección de estas enzimas,
los test microbiológicos de Hodge y Masuda, nos permite evaluar la actividad
hidrolítica de las enzimas con respecto a los carbapenems, mientras que otros ensayos
65
Conclusiones
• El 100% de las cepas estudiadas según la tabla 1, reportaron zonas de inhibición de imipenem sensibles lo que las ubica como cepas no sospechosas de
carbapenemasas.
• La utilización de imipenem es vital para sospecha de resistencia a carbapenemasas en Klebsiella pneumoniae.
• Es de suma importancia la vigilancia laboratorial para la detección de resistencias y así evitar el uso de antimicrobianos no útiles, que lejos de ayudar
al paciente lo perjudican.
• Los resultados de esta investigación no son confirmatorios ni de gran impacto por la cantidad de muestras estudiadas y así mismo porque dichas cepas no
66
Referencias
1. Libros: Características Generales. E. coli. 2003. Disponible en URL:
http://biblioweb.dgsca.unam.mx/libros/microbios/Cap5/
2. “Calidad del diagnóstico clínico y microbiológico de la sepsis”
Universidad de Cadiz. 2003. Disponible en URL:
http://www.medigraphic.com/pdfs/iner/in-2003/in031d.pdf
3. Prescott L, Harley J y Klein D. Microbiología. 4ª edición. McGraw-Hill
Interamericana, 1999. (280-290).
4. Madigan M, Martinko J y Parker J. Brock Biología de los Microorganismos.
10ª edición. Trad.: Fernández, M. Et. Al. España Prentice-Hall Pearson.
Educación S.A., 2004. (190-195)
5. Volk W. Microbiología Básica. 7. Ed. Trad.: A. Castilleja, México Harla S.A.
1996. (200-210).
6. Pelczar M, Reid y Chan E. Microbiología. 4. Ed. Trad.: A. Capella y J. Tay.
México. McGraw Hill. 1982. (157-165).
7. Jawetz E et. al. Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. 14ava.
Ed. Manual Moderno. 1992. (89-97).
8. Alcamo E. Fundamentals of Microbiology. Lones and Bartlett Publishers Inc.
USA. 2000. (111-115).
9. Controlling the spread of carbapenemase-producing Gram-negatives: therapeutic
approach and infection control. Y. Carmeli y cols., Clinical Microbiology and
Infection, 16: 102–111, 2010
10. Acquired carbapenemases in Gram-negative bacterial pathogens: detection and
surveillance issues. V. Miriagouy cols., Clinical Microbiology and Infection, 16:
67 11. Carbapenemasas. A Brief Review for Pediatric Infectious Disease Specialists G.
Overturf. Pediatric Infectious Diseases Journal, 29: 68–70, 2010.
12. KPC-2, Buenos Aires, Argentina. Pasteran F. y cols., Emerging Infectious
Diseases, 14(7):1178-80; 2008. Programa Nacional de Control de Calidad en
Bacteriología INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
13. Sensitive screening tests for suspected class A carbapenemase production in
species of Enterobacteriaceae. Pasteran F. y cols., Journal of Clinical
Microbiology., 47(6):1631-9; 2009
14. Controlling false-positive results obtained with the Hodge and Masuda assays
for detection of class A carbapenemase in species of Enterobacteriaceae by
incorporating Boronic Acid. Pasteran F, y cols., Journal of Clinical
Microbiology, 48(4):1323-32, 2010
15. An Outbreak of Infection due to beta-Lactamase Klebsiella pneumonia
Carbapenemase 2–Producing K. pneumoniae in a Greek University Hospital:
Molecular Characterization, Epidemiology and Outcomes Souli M. y cols.,
68 ANEXOS