Liquid Scintillation Counting

41

Los resultados del análisis con respecto a la posición de los azucares entre cada una de las lectinas (tabla 5, anexo 1) indican que no hay diferencia en la posición o distribución que guardan los patrones encontrados en común en las cinco lectinas empleadas (ANOVA, p > 0.05). Este mismo efecto se determinó para la posición que presentaron los azúcares entre cada una de las lectinas (ANOVA, p > 0.05).

Sin embargo en lo que respecta a la frecuencia con que se presentan cada uno de los patrones es diferente en cada lectinas (ANOVA, p < 0.05). Con respecto a la interacción entre los patrones y su posición entre los espermatozoides no existe relación alguna, el tipo de lectina no influye para determinar la posición de cada patrón, es decir, se encontraron los mismos seis patrones principales (A-E y Z) en todas las lectinas analizadas.

DISCUSIÓN

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Este es el primer trabajo en el que se estudia la determinación de residuos glicosídicos en la membrana de los espermatozoides de C. humboldtianum, su distribución, patrones presentados y frecuencia. Aunque en primera instancia sólo se trata de una caracterización, estos resultados pueden contribuir para estudios posteriores como determinar si la distribución de los azúcares tienen relación directa con el éxito de la fertilización de esta especie, también puede contribuir como base para la realización de protocolos que conlleven a desarrollar biotecnologías que permitan un manejo adecuado para su conservación o cultivo.

El empleo de las lectinas Con A, WGA, PNA, PSA y UEA para caracterizar los residuos glicosídicos presentes en la membrana de los espermatozoides de C. humboldtianum ofrece resultados positivos, ya que demuestra la presencia de todos los azúcares que reconocen cada una de las lectinas. Todos los residuos glicosídicos encontrados (αMan, αGlc, GlcNAc(b1,4GlcNAc)1-2, β-galactosa, manosas terminales, glucosa, Fuc) están presentes en la cabeza, pero en el flagelo del espermatozoide es escasa o nula la presencia de α- manosa,α-glucosa y de N-acetilglucosamina.

Aunque estos azúcares se observaron en toda la superficie de la membrana del espermatozoide, se encontraron cinco patrones principales de fluorescencia en mayor densidad en la cabeza que en el flagelo, estudios particulares realizados con peces teleósteos sugieren un comportamiento similar a la especie de estudio ya que al caracterizar las glicoproteínas de la membrana plasmática durante la espermatogénesis en los espermatozoides de los géneros Xiphophorus maculatus y del chilensis Elasmobranch

Schroederichthys (Rojas, et al. 2001), utilizando las lectinas concanavalina A (ConA) y

DISCUSIÓN

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comportamiento análogo. Por otra parte en Xiphophorus, una especie vivípara que presenta espermatozoides acrosomales, espermatocitos primarios y espermátidas de forma redondeada, en los que se empleó como marcadores a las mismas lectinas descritas anteriormente mostró que toda la superficie de la célula se marcó por ambas lectinas. Mientras que, en los espermatozoides maduros se observó una fluorescencia discreta y no aleatoria exclusivamente en la superficie de la cabeza del espermatozoide (Tokalov y Gutzeit 2007). Esta descripción coincide con las observaciones para esta especie y aun cuando las cinco lectinas probadas están presentes en toda la cabeza del espermatozoide de

C. humboldtianum, es posible observar dos patrones que se presentan con mayor

frecuencia en comparación con el resto.

Se ha demostrado que las lectinas unidas a FITC, permiten analizar la condición de los espermatozoides a través de la movilidad, viabilidad, funcionalidad de la membrana plasmática y metabolismo, que determinan las principales funciones de los espermatozoides para llegar y entrar en el óvulo durante la fertilización (Cabrita, 2009). Bajo esta premisa la movilidad, viabilidad, funcionalidad de la membrana plasmática de los espermatozoides de C. humboldtianum analizados presentaron buenas condiciones de acuerdo a los valores determinados para cada parámetro.

Por otro lado, un aspecto relevante es la caracterización seminal, que permite identificar parámetros de normalidad, con el fin de seleccionar e identificar posibles donantes para los bancos de germoplasma de peces (Fresneda, 2004). En ese sentido, existen daños que afectan los parámetros de calidad de los espermatozoides como: motilidad, viabilidad, funcionalidad de la membrana plasmática, metabolismo, entre otros, que determinan las principales funciones de los espermatozoides de los peces para llegar y entrar en el óvulo

DISCUSIÓN

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durante la fertilización (Cabrita, 2009), para el caso de C. humboldtianum la presencia de estos azucares permiten determinar no solo parámetros de normalidad sino inferir la calidad espermática, como un aspecto básico de la biología de la especie que garantice una fertilidad alta para mantener el tamaño de la población en condiciones reproductivas adecuadas o estables.

De acuerdo con los resultados del ANOVA, indican que entre las cinco lectinas empleadas, no hay diferencia significativa en cuanto a la distribución que presentan en la membrana del espermatozoide C. humboldtianum, ya que los cinco patrones observados, se encontraron en común en las cinco lectinas y demuestran que no hay interacción entre lectinas y patrones, es decir, que cada una de las lectinas no tiene un patrón específico que sea característico de la lectina en cuestión, aunque existe una diferencia significativa en cuanto a la frecuencia con que se presentan. En ese sentido los patrones A (mayor fluorescencia entre el límite de la cabeza y el flagelo) y B (mayor fluorescencia en el centro de la cabeza) quienes fueron los de mayor incidencia en las cinco lectinas empleadas, indicativo de que los azúcares αMan, αGlc, GlcNAc(b1,4GlcNAc)1-2, β- galactosa, manosas terminales, glucosa, y Fuc encontrados, pudieran servir como factor de iniciación para el reconocimiento de la región del micropilo del huevo (Cabrita, et. al., 2009) y pueda llevarse a cabo con éxito la fertilización y evitar una polispermia, ya que son indicadores al momento de introducción del primer espermatozoide para cerrar inmediatamente el canal del micropilo En ese sentido es posible inferir que en los espermatozoides de peces carentes de acrosoma, como es el caso de C. humboldtianum los residuos glicosídicos están distribuidos en toda la superficie de la membrana y aunque no existen estudios similares a este, los patrones identificados pudieran asociarse con el estado de madurez del espermatozoide, ya que se ha demostrado que los diferentes patrones de

DISCUSIÓN

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tinción de las lectinas se pueden utilizar como una herramienta analítica para distinguir diferentes células de interés, lo mismo que en análisis histoquímicos de testículos las diferentes lectinas, muestran notablemente diferentes patrones de tinción asociados con etapas del desarrollo de la espermatogénesis en células de mamíferos (Tokalov & Gutzeit, 2007), lo cual plantea la posibilidad de otros estudios que conlleven a dilucidar estos aspectos.

CONCLUSIONES

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-Se establecieron las condiciones para el marcaje de los azúcares encontrados en la membrana de los espermatozoides de Chirostoma humboldtianum así como la técnica de centrifugación adecuadas para observar los flagelos completos.

-Los residuos glicosídicos presentes en la membrana de los espermatozoides de C.

humboltianum, son: αMan, αGlc, GlcNAc(b1,4GlcNAc)1-2, β-galactosa, manosas

terminales y glucosa, así como Fucosa.

-Es posible inferir que estos azúcares en conjunto son característicos de esta especie, ya que en estudios realizados con otros grupos de organismos (mamíferos por ejemplo), no se han reportado todos los azúcares que marcan las lectinas en la membrana de los espermatozoides en estudio.

-La microscopía confocal revela la existencia de seis patrones de fluorescencia en la superficie de la membrana de los espermatozoides de C. humboldtianum, dichos patrones se presentaron en las cinco lectinas empleadas.

-Existen dos grupos que destacan por su frecuencia, son los clasificados como patrón A (mayor concentración de fluorescencia entre el límite de la cabeza y el flagelo) y el patrón B (mayor intensidad de fluorescencia en el centro de la cabeza).

Respecto a la evaluación espermática, los espermatozoides de C. humboldtianum utilizados presentaron movimiento vigoroso y rectilíneo y se encontró más del 75% de espermatozoides en movimiento, estas características se consideran con mayor poder fecundante. La viabilidad fue del 80.43% que indica un alto porcentaje de espermatozoides vivos, los que tienden a favorecer una alta fertilización y una concentración espermática de 1.82 x 1010 espermatozoides/ µl.

CONCLUSIONES

47 Recomendaciones

Se considera conveniente realizar análisis para cuantificar la intensidad de la fluorescencia ya que la relación que existe entre la fluorescencia y su intensidad permite estimar la concentración nominal de los residuos glicosídicos.

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