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El análisis genético de la RNasa E es complicado de realizar debido a que esta enzima es esencial para la supervivencia de E. coli. La RNasa E (número de acceso P21513) es una proteína con actividad endorribonucleasa de 1061 aminoácidos. Sin embargo, sólo la región N-terminal de la RNasa E parece ser necesaria para la viabilidad celular {Lopez, 1999 #315}{Ow, 2000 #4} y es la región más conservada en una gran variedad de especies bacterianas {Kaberdin, 1998 #360}. En cambio, la región C-terminal de la RNasa E, la cual no es esencial para la viabilidad de E. coli, está implicada en la formación del complejo multienzimático denominado degradosoma formado por las enzimas RNasa E, PNPasa, RhlB y enolasa. Los estudios genéticos hasta ahora realizados con diferentes mutantes para analizar el papel funcional in vivo de la RNasa E y del degradosoma son complejos de interpretar. Así por ejemplo, una forma truncada de la RNasa E (rne∆225), la cual carece de los últimos 217 aminoácidos del extremo C-terminal e incapaz de asociarse a la PNPasa para forma el degradosoma, pero con una actividad catalítica normal, fue capaz de complementar a los mutantes termosensibles rne-1 y rne-3071 {Claverie-Martin, 1989 #8}. Sin embargo, al poder funcionar la RNasa E in vivo como un dímero {Mackie, 1997 #340} {Coburn, 1999 #337}, la interpretación de los resultados obtenidos de esta complementación deben de tener en cuenta que ambos alelos, rne-1 y el rne-3071, conducen a la síntesis de la RNasa E de longitud completa y con una actividad catalítica termosensible. Entonces aunque los mutantes termosensibles rne-1 y rne-3071 puedan ser complementados por el alelo rne∆225 a 44°C {Claverie-Martin, 1989 #8} no es posible excluir la posibilidad de que la complementación de lugar a una mezcla de dímeros conteniendo una subunidad truncada Rne∆225 catalíticamente activa, pero incapaz de formar el degradosoma y una subunidad de longitud completa Rne-1 o Rne-3071 catalíticamente defectuosa, pero conteniendo la región C-terminal de la RNasa E, con lo cual la PNPasa, RhlB y enolasa podrían asociarse, y por tanto, formar el degradosoma en el mutante

rne-1 o rne-3071 complementado con rne∆225. Entonces, para el estudio del papel

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útil utilizar este tipo de mutantes termosensibles. Además, el análisis de mutantes de la RNasa E expresadas a partir de plásmidos son complicadas debido al alto nivel de recombinación homóloga que ocurre entre el alelo de rne portado en el plásmido y el gen situado en el cromosoma {Claverie-Martin, 1989 #8}.

Para evitar todos los inconvenientes anteriormente comentados, en el análisis del papel funcional in vivo de la RNasa E y del degradosoma, nosotros decidimos generar una cepa de E. coli, con una deleción del gen rne cromosómico (rne∆1018::bla), en la cual se reemplazó el sitio de unión al ribosoma y los primeros 1018 aminoácidos de la proteína RNasa E por un cassette de resistencia a la ampicilina (Apr). Para generar una deleción cromosómica del gen rne, se usó una modificación del método de reemplazamiento génico descrito por Hamilton y colaboradores {Hamilton, 1989 #553}. En nuestro caso particular el fragmento de DNA XmnI-XmnI del gen rne el cual contenía los 212 nucleótidos de la región 5’UTR, el sitio de unión al ribosoma, y los primeros 1018 aminoácidos de la región codificante de la RNasa E, fue reemplazado por otro fragmento de DNA portando el gen bla, que confiere la Apr, para generar el alelo rne∆1018::bla (Fig. 3.1). Posteriormente cointegrantes del plásmido pQLK61 (derivado del plásmido pMAK705 conteniendo el cassette rne∆1018::bla) en la cepa MC1061 fueron resueltos en presencia del plásmido de bajo número de copias, pQLK26 (rne+ Kmr), el cual porta una copia del alelo salvaje del gen rne. Varios cointegrantes resueltos fueron obtenidos y todos ellos contenían la deleción del gen

rne (rne∆1018::bla) insertado en el cromosoma a juzgar por los resultados del análisis

mediante PCR (resultado no mostrado). El alelo rne∆1018::bla fue transducido dentro de la cepa derivada de la MG1693 (thyA715) llevando el plásmido pQLK26 (rne+ Kmr) por co-transducción con pyrC. Después de este paso, el alelo recA56 fue introducido por co-transducción para prevenir la recombinación homóloga entre la secuencia residual del rne en el cromosoma y aquella portada por cualquier plásmido residente.

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Figura 3.1. Representación esquemática de la construcción del alelo rneΔ1018::bla. En la parte superior se muestra la estructura del gen rne incluyendo el sitio de inicio de transcripción, y los codones de iniciación (AUG) y de terminación (UAA) de la traducción. La RNasa E contiene 1061 aminoácidos {Casaregola, 1994 #372} {Casaregola, 1992 #373}. En la parte inferior se muestra el alelo rneΔ1018::bla retiene 149 nucleótidos del 5’UTR del transcrito

rne y el extremo 3’ de la secuencia codificante, que codifica para los últimos 43 aminoácidos del extremo C-

terminal de la proteína. El fragmento de DNA XmnI-XmnI del gen rne fue reemplazado por un cassette de expresión con el gen bla (Apr) como se describe en materiales y métodos.

Mediante análisis de PCR y Southern Blot (resultados no mostrados) fue confirmado la ausencia del gen rne en el cromosoma de la nueva cepa SK9705 (rne∆1018::bla recA56/pQLK26 [rne+ Kmr]). Posteriormente transformamos la cepa SK9705 con el plásmido pSBK1 (rne+ Cmr) el cual es incompatible con el plásmido residente pQLK26 (rne+ Kmr). Los transformantes fueron crecidos en medio líquido LB suplementado con timina y cloranfenicol durante tres días para desplazar el plásmido residente y de este modo obtener la cepa SK9714 (rne∆1018::bla recA56/pSBK1 [rne+ Cmr]).

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3.2 Introducción de mutaciones aleatorias en la región codificante del dominio