4.3 Spatio-Temporal Change Detection module
6.1.3 Long-term
▪ Estandarización inicial de condiciones cromatográficas.
Teniendo en cuenta que uno de los objetivos de la presente investigación involucró la realización de estudios de permeabilidad aparente en el modelo Caco-2, en los cuales las muestras debían ser preparadas en HBSS; se desarrolló un método HPLC-UV para la cuantificación de rutina (componente mayoritario del extracto en estudio) y quercetina (metabolito de rutina), en este medio a pH 6.5 y 7.4. Para esto se utilizó el cromatógrafo líquido Chromaster RS® (Hitachi, Tokyo, Japan).
La química de la fase estacionaria se eligió con base en la revisión bibliográfica (Tabla 1- 4) y se utilizó la siguiente columna: Luna® C18, 3 μm, 75 x 4.6 mm, poro de 100 Å (Phenomenex, Torrance, CA, EE.UU.).
El resto de condiciones operativas del sistema se establecieron a partir de la evaluación de los siguientes métodos de partida:
- Fase móvil método 1: Metanol – ácido fórmico 0.1%, en proporción 35:65. (Tang et al., 2009).
- Fase móvil método 2: Metanol – ácido acético 0.5%, en proporción 30:70. (Ou-yang et al., 2013).
- Fase móvil método 3: Acetonitrilo – ácido fórmico 0.1%, en proporción 15:85 (He et al., 2013).
En todos los casos, el flujo de partida fue de 1 mL/min, el volumen de inyección 10 µL, el horno se ajustó a 30ºC y el detector se programó para registrar señales en dos longitudes de onda (λ): 256 y 360 nm.
Las muestras utilizadas en la fase inicial del desarrollo del método consistieron en la mezcla de estándares de rutina y quercetina a concentración 10 µM, preparadas en un diluyente, a partir de un stock de 2 mM en DMSO. El diluyente se estableció teniendo en cuenta las características de solubilidad de los compuestos (Tabla 1-1) y la compatibilidad de la mezcla fase móvil/muestra, entendida como la ausencia de cambios físicos como turbidez, precipitación e inmiscibilidad entre fases, tras un periodo de reposo de 24 h en las condiciones de trabajo habituales.
Con estas primeras muestras se realizaron ajustes sobre la proporción de solventes, gradiente, flujo, temperatura y longitud de onda de cada uno de los métodos de partida, para optimizar la respuesta de los parámetros de aptitud del sistema. En un paso posterior se prepararon mezclas de los estándares a concentración 0.1 µM y se midió la relación S/R con respecto al diluyente. Se eligió para ensayos posteriores, el método ajustado para el cual, las señales de los analitos, cumplieran los requisitos de aptitud del sistema de la FDA (Tabla 1-2) con la mejor relación S/R.
▪ Preparación de muestras en HBSS y ajustes finales de las condiciones
cromatográficas.
Los ajustes finales del método se realizaron ensayando mezclas de los estándares a concentración 0.5 y 5.0 µM, preparadas en HBSS pH 7.4 a partir del stock de 2 mM (DMSO). Las muestras simuladas (200 µL) fueron acidificas inmediatamente hasta pH 4 con ácido fórmico (0.5 μL, 85%) y diluidas con metanol en relación 1:1. Se aplicó vortex
por 2 min y centrifugación a 20.000 xg y 4ºC durante 15 min (Megafuge 8R®, Thermo Scientific, Waltham, MA, EEUU). El sobrenadante fue filtrado a través de membranas PTFE de 0.22 µm e inyectado en el sistema HPLC.
El método ajustado se ensayó con muestras conteniendo rutina, quercetina, Q3OG (metabolito conjugado proveniente de rutina), verapamilo (compuesto utilizado como inhibidor de transportadores en estudios de permeabilidad) y propranolol (compuesto utilizado como control de alta permeabilidad). Las condiciones finales se establecieron teniendo en cuenta los requisitos de aptitud antes mencionados y la especificidad en la detección de los analitos de interés.
▪ Estandarización reacción con β-glucuronidasa/arilsulfatasa.
Debido a la no disponibilidad de estándares analíticos comerciales de los conjugados glucurónido y sulfato derivados de rutina, se utilizaron las enzimas β-glucuronidasa y arilsulfatasa, que hidrolizan estos metabolitos para cuantificarlos indirectamente en forma de sus compuestos precursores.
Para la estandarización de las condiciones de reacción, se prepararon soluciones estándar de Q3OG en HBSS pH 7.4 a concentración 10 μM, las cuales fueron sometidas a reacción con la mezcla de enzimas. De acuerdo al protocolo sugerido por el fabricante1, se requerían
58500 unidades Fishman (en función de β-glucuronidasa) y 16 h de incubación a 37ºC para hidrolizar la totalidad de los conjugados glucurónido y sultafo presentes en una muestra de 10 mL de orina. Tomando como referencia esta información, se utilizaron 1170 unidades para la reacción en un volumen de 200 μL y un tiempo de incubación inicial, en baño de maría, de 2 h. El pH de las muestras se ajustó a 5.5 con ácido acético (1%) y se utilizaron 10 μL de una solución tampón de acetato de sodio 1 M para mantenerlo. Tras la reacción, las muestras fueron tratadas con ácido fórmico hasta pH 4 y procesadas normalmente. Se realizaron varios experimentos a fin de disminuir las unidades y tiempo de incubación, haciendo seguimiento a la hidrólisis del glucurónido por observación de la señal del conjugado y de quercetina en el cromatograma.
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Finalmente, se evaluó la estabilidad de los analitos bajo las condiciones de reacción definidas. Para esto se utilizaron soluciones estándar de rutina y quercetina de concentración 0.5 y 5.0 µM en HBSS pH 7.4, las cuales fueron ajustadas a pH 5.5 y mantenidas en incubación a 37ºC por el tiempo de reacción estandarizado. Tras este tratamiento, se determinó la recuperación de los analitos respecto a la concentración de soluciones estándar recién preparadas.
▪ Validación de la metodología.
La metodología desarrollada se validó para la cuantificación de rutina y quercetina, evaluando las características sugeridas por la ICH para el fin propuesto: linealidad, exactitud, precisión, especificidad y rango (ICH, 2005).
La linealidad se determinó a partir del análisis de regresión a curvas de calibración de al menos 5 niveles de concentración, en el rango de 0.1 a 10 µM. Los distintos niveles se prepararon por dilución del stock de 2 mM (DMSO) de cada analito, en HBSS pH 6.5 y/o pH 7.4. Se estableció como rango los límites de cada línea de regresión, siendo LLOQ el menor nivel de concentración con exactitud y precisión dentro de ± 20%. El límite de detección (LOD, por sus siglas en inglés) se estimó con base en la relación S/R de 3:1 (ICH, 2005).
La exactitud y la precisión se establecieron por evaluación del porcentaje de recuperación y CV de muestras independientes a las de las curvas de calibración, preparadas a 3 concentraciones, cubriendo el rango definido individualmente para cada analito, bajo condiciones de repetitividad (3 concentraciones / 3 réplicas por concentración, un día) y de precisión intermedia (3 concentraciones / 3 réplicas por concentración, tres días) (ICH, 2005).
Adicionalmente se evaluó la estabilidad de los analitos en las condiciones del ensayo de permeabilidad, sometiendo estándares de rutina y quercetina de concentración 0.5 y 5 μM preparados con HBSS pH 7.4, a calentamiento por 2 h a 37ºC, con muestreos a los 5 minutos y luego cada 30 minutos.
Finalmente, la misma metodología fue validada para la cuantificación de propranolol en HBSS pH 7.4, para esto se prepararon curvas de calibración en el rango de 0.25 a 25 µM
a partir de un stock de 100 mM (DMSO), con controles de exactitud y precisión de 0.25, 2.5 y 25 µM. En este caso no fue necesario el tratamiento de las muestras con ácido fórmico.