Management and control system

proteína Rv0576

En primer lugar, se construyeron los mutantes por deleción de cada uno de los dos genes Rv0576 y Rv0577, generándose las cepas M. tuberculosis Δ76 y Δ77

(apartado 4.1). El hecho de que ambas cepas resultaran ser RN− apoyaba la implicación de ambos genes en dicho fenotipo. Además, el análisis mediante Western-blot indicaba que la cepa Δ76 sobreexpresaba la proteína Rv0577, lo que estaría de acuerdo con la función reguladora propuesta para Rv0576.

Inicialmente, estos resultados podían explicarse en base a dos hipótesis:

1.- La tinción con rojo neutro dependería directamente de la presencia de la proteína Rv0577 en una concentración crítica. El fenotipo RN− _{de los dos mutantes sería}

debido a una concentración inadecuada de la proteína Rv0577, la cual se encontraba ausente en la cepa Δ77 y sobreproducida en la cepa Δ76. La función del gen Rv0576

sería controlar la expresión del gen Rv0577.

2.- Además del gen Rv0577 (que sería esencial para la tinción), existirían otros

genes adicionales implicados en el fenotipo RN+ en M. tuberculosis. La proteína

Rv0576 regularía no sólo la expresión del gen Rv0577 sino también la de estos otros

genes hipotéticos.

Para esclarecer cuál de estas dos hipótesis era correcta, se estudió la función de la proteína Rv0576 mediante fusiones transcripcionales y el análisis de la expresión global con microchips de DNA. Los resultados de las fusiones con el promotor del operón Rv0576-Rv0577 nos permitieron confirmar que la proteína Rv0576 era,

efectivamente, un regulador transcripcional que reprimía la expresión del operón. Este resultado se corroboró con el análisis por microchips que mostró, además, que la proteína Rv0576 regulaba únicamente la expresión del operón Rv0576-Rv0577

(apartado 4.2.2).

Aún así, no se puede descartar la posibilidad de que, en presencia de algún estímulo desconocido o condición ambiental diferentes de las utilizadas en los ensayos, la proteína Rv0576 pueda regular la expresión de otros genes. En este sentido cabe destacar que los genes Rv0576-Rv0577 no aparecen desregulados en ninguno de los

múltiples trabajos en que se ha analizado la expresión global de M. tuberculosis en

respuesta a diversas condiciones ambientales (estrés térmico, anaerobiosis, privación de nutrientes, etc.) y durante la infección in vivo (Stewart et al., 2002; Fisher et al., 2002;

Betts et al., 2002; Schnappinger et al., 2003; Dahl et al., 2003; Bacon et al., 2004;

Talaat et al., 2004, entre otros). Por lo que no parece que la expresión de los genes

Rv0576-Rv0577 responda a ninguno de estos estímulos. Esto podría sugerir que la

función de la proteína Rv0576 sería únicamente mantener un bajo nivel de expresión del operón Rv0576-Rv0577, en las condiciones examinadas hasta el momento.

En realidad, los reguladores de la familia SmtB/ArsR, a la que pertenece Rv0576, acostumbran a funcionar como represores en ausencia de un inductor, generalmente un metal. La unión del inductor a la proteína reguladora inhibe la unión de ésta al operador, con lo que se activa la expresión de los genes regulados (Busenlehner

podemos imaginar que dicho inductor hipotético no se hallaba presente a la concentración adecuada en ninguna de las condiciones ensayadas ya que se detectó la represión de un gen y, por lo tanto, no hay ningún indicio que nos haga presuponer que no reprimiría también los otros posibles genes regulados.

También cabría la posibilidad de que la variabilidad inherente a la tecnología de los microchips de DNA, especialmente en el análisis de la expresión, nos haya impedido detectar otros genes regulados (ver apartado 8.3 en Anexo). Si esto fuera así, la posible secuencia de unión del regulador, identificada en la región promotora del operón

Rv0576-Rv0577 (Fig. 4.15), podría encontrarse en otros promotores del genoma de

M. tuberculosis. Sin embargo, cuando realizamos un análisis bioinformático de dicho

genoma, buscando secuencias similares, no pudimos encontrar ninguna, ni siquiera permitiendo 3 mutaciones en cada una de las repeticiones (búsqueda de patrón en el genoma de M. tuberculosis, en regiones de 200 pb anteriores al codón de inicio de

traducción, realizada en el TubercuList http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/). Es decir, parece que en el genoma no existen otras secuencias diana para el regulador Rv0576, aparte de la existente en su propio promotor.

Conjuntamente, estas observaciones desmentirían la hipótesis de que el fenotipo RN− de la cepa Δ76 fuera debido a la existencia de otros genes implicados en la tinción, desregulados en ausencia de la proteína Rv0576. Por lo tanto, con los resultados analizados hasta el momento, parecería que la explicación más plausible del fenotipo RN− de las dos cepas mutantes, Δ76 y Δ77, sería que la tinción con rojo neutro dependiera de unos niveles críticos de la proteína Rv0577.

Una tercera hipótesis que podría explicar el fenotipo RN− de la cepa Δ76, sería que la proteína Rv0576, además de ser un regulador transcripcional, realizara alguna otra función que interviniera en la reacción con rojo neutro. En realidad, esta proteína es bastante más larga que la mayoría de reguladores SmtB/ArsR. Así, mientras que el extremo N-terminal de Rv0576 es similar a los reguladores de esta familia, el extremo C-terminal es similar a proteínas hipotéticas y contiene el dominio conservado DUF704 (Pfam05146.6), de función desconocida pero presente en muchas proteínas bacterianas y eucariotas0F

1_{. Dentro del género}

Mycobacterium, los genes Rv0576-Rv0577 parecen

estar restringidos al complejo M. tuberculosis (Huard et al., 2003; y BLAST con

genomas finalizados y en progreso de otras micobacterias1F

2_{). Sin embargo, la reciente} secuenciación del genoma de Rhodococcus sp. RHA1 (McLeod et al., 2006) ha

mostrado que un operón similar se halla también en este microorganismo, pero el gen equivalente a Rv0576 aparece dividido en 2 ORFs que codificarían el regulador

transcripcional (78% de similitud con la región N-terminal de Rv0576) y la proteína con el dominio DUF704 (75% de similitud con la región C-terminal de Rv0576), respectivamente. Esto respaldaría la hipótesis de que la proteína Rv0576 sea el resultado de la fusión de un regulador transcripcional y de otra proteína de función desconocida. Aún así, el gen Rv0576, ausente en el genoma de M. smegmatis, no es necesario para la

complementación heteróloga de M. smegmatis (Andreu et al., 2004b), ni confiere el

fenotipo RN+ por sí mismo (resultados no presentados). Por lo tanto, aunque esta proteína tuviera otra función, además de la de regulador transcripcional, no parece que ésta estuviera implicada la tinción.