DE Rattus norvegicus
Debido a que los macrófagos como células especializadas, mantienen activo su metabolismo oxidativo y los sistemas de regulación de la expresión genética, el cultivo primario nos permite revelar la expresión de Citocromos P450 específicos detectados a partir de RNA mensajero.
No existe, una explicación molecular razonable a las diferencias en la expresión basal de algunos P450, en cualquier estirpe celular, una de las primeras hipótesis sería la existencia de niveles distintos de factores reguladores clave. 141
En nuestro caso, la expresión basal está influenciada por la interacción con los componentes solubles el cultivo celular, sin tratamiento.
La expresión de los P450, es influenciada (inducida o reprimida) por los propios xenobiótios, en nuestro estudio representado por Aspirina y por los componentes del EHSI.
Se presenta evidencia innovadora del efecto generado al someter a cultivos primarios de macrófagos peritoneales de Rattus norvegicus Sprague Dawley al contacto con los componentes solubles del extracto hidroalcohólico de Sacha Inchi (reconocido por su actividad antioxidante) y en contacto con Aspirina; en la evaluación
de la expresión de los genes P450 1A1, P450 2C24, P450 2E1, P450 3A2 y P450 4A1, los cuales por si mismos son fuente natural de radicales libres.
La dosis de Aspirina es compatible con la dosis farmacológica, muy por debajo de la dosis tóxica (10g) y la dosis letal media DL50 20-30g. 99
Los resultados en nuestro estudio nos permiten tener un punto de comparación con P450 humanos. Los mecanismos de biotransformación catalizados por las enzimas Citocromo P450 en animales, sin embargo, no siempre pueden ser extrapolados y ajustados a la cinética en humanos. 142 por lo cual es necesario en base a estos
resultados realizar estudios mas detallados en células humanas.
El estudio en macrófagos peritoneales, marca una línea de base importante, destacando la presencia constitutiva de los citocromos, en estas células. A través del sistema control sin tratamiento, detectamos que los Citocromos P450 1A1, P450 2E1, P450 2C24, P450 3A2 y P450 4A1, en macrófagos peritoneales de Rattus norvegicus Sprague Dawley, no son constitutivos de estas células y cualquier hallazgo, en la expresión de los mencionados genes P450 obedecen a inducción en la expresión genética.
Si bien podemos detectar fácilmente la inducción genética, con los estimulos detallados en los tratamientos, sin embargo, no podríamos asegurar, si se observan efectos inhibitorios frente a los mismos tratamientos.
Resultados del equipo de ADN Uchumayo, determinando la actividad antioxidante a través del ensayo DPPH, en el sistema macrófagos peritoneales de
Rattus norvegicus, tratados con EHSI, a las concentraciones de 10, 100 y 200g/mL, y por distintos tiempos, demostraron que el extracto hidroalcoholico de semillas, conserva efecto antioxidante.138 Estos mismos ensayos concluyen que Sacha Inchi, inducen la
expresión de interleuquina 1, e inhibe la expresión del gen COX-2, induciendo también la expresión de iNOS.138
Algunos estudios proponen que el consumo cotidiano de Sacha Inchi, permitiría prevenir, retrazar o disminuir algunos síntomas de enfermedades crónicas o degenerativas143 incluyendo el cáncer, sin embargo, nuestros resultados muestran que
algunos componentes del extracto estarían implicados en la inducción del Citocromo P450 1A1, por lo que el consumo frecuente de Sacha Inchi podría contrariamente inducir la carcinogénesis, a traves de la activación de pro-carcinógenos.
El estudio de los fitoconstituyentes en hojas y tallos de Plukenetia volubilis L., demostraron actividad antioxidante “in vitro” del extracto etanólico, sobre la
lipoperoxidación inducida por Fe/ascorbato en hígado de Rattus rattus variedad Albinus.
144 La Línea celular HeLa tratada con extractos obtenidos con diferentes solventes y
empleando diferentes partes de la planta Plukenetia volubilis, mostraron regiones afectadas en su morfología, compatibles con apoptosis, sin embargo, en las líneas 3T3 de células normales y CHO, no mostraron efecto citotóxico.24 Si vemos a Sacha Inchi
como un recurso natural, materia prima para la obtención de drogas, muchos estudios deberán ser desarrollados con diferentes modelos celulares, antes de ser empleados en humanos. Sacha Inchi, es actualmente un artículo de bandera, exportado a etnias que no tienen historia de consumo y que pueden reaccionar de manera diferente a los flavonoides que contiene. Se sabe que los flavonoides en la dieta humana pueden reducir el riesgo de varios tipos de cáncer, especialmente de mama hormono- dependiente y cánceres de próstata,22 sin embargo, conocer su interacción con los
fármacos, permitirá un manejo racional de los medicamentos, sobre todo en estos tiempos en que el paciente por cuenta propia emplea medicina complementaria.
Al ser este estudio incial, la primera evidencia en la identificación de cDNA de los citocromos elegidos es incierta, el control de carga a través de la expresión de beta- Actina, nos indica que no existen diferencias significativas en la cantidad de muestra.
El estudio de expresión de CyP1A1, CyP2C24, CyP2E1, CyP3A2 y CyP4A1, en el sistema Control sin tratamiento, fue realizado en cultivo de macrófagos peritoneales de rata, que no fueron tratados con EHSI, ni con Aspirina, considerándose como “expresión basal o Constitutiva”. Cinco días posteriores a la inoculación de endotoxina a nivel de la cavidad peritoneal, son suficientes para disminuir la sensibilización que pudiera generar estrés oxidativo.
Ninguno de los P450 estudiados CyP1A1, CyP2C24, CyP2E1, CyP3A2 y CyP4A1, son expresados en macrófagos del cultivo Control sin tratamiento, por lo que podemos afirmar que no son genes de expresión constitutiva para estas proteínas. Cualquier expresión por modificación del medio, se debería al factor introducido.
Los macrófagos peritoneales de la variedad Sprague Dawley tratados sólo con Aspirina 5 mM, estimularon la síntesis de los citocromos P450 2C24 y P450 4A1, en ambos casos la inducción se da en las primeras horas de incubación 6 y 12 horas, decayendo a las 24 horas en el medio de cultivo sin el agregado de nutrientes.
Aunque dos citocromos hayan sido inducidos por Aspirina, no podemos señalar que el mecanismo de transduccion de señales por los que se haya expresado sean el mismo, el comportamiento de ambos citocromos, en distintos tiempos de incubación y
a diferentes concentraciones de EHSI, nos pueden ayudar a entender la relación que habría en los mecanismos de expresión de ambos citocromos.
Los cultivos de macrófagos peritoneales de Rattus norvegicus variedad Sprague Dawley, nos muestran un hallazgo interesante al detectar la expresión de citocromo P450 1A1, con el tratamiento de EHSI de concentración 100g/mL y 6 horas de incubación con Aspirina 5mM.
El sistema enzimático Citocromo P450 1A1 está implicado en la activación de carcinógenos como el benzo[a]pireno, 7,12-dimetilbenz[a]antraceno, aflatoxina B1 y aminas aromáticas heterocíclicas derivadas de las carnes. Fármacos prescritos con receta médica, como Rifampicina y Omeprazol, inducen el Citocromo P450 1A1,6
colocando a los pacientes tratados con estos fármacos en una posición de alto riesgo. El flavonoide 2,3,7,8-teraclorodibenzo-p-dioxin componente de Sacha Inchi, induce la actividad de P450 1A1.145,146
Las flavonas que son estructuras que han perdido el grupo hidroxilo o metoxilo, inducen P450 1A1 en hígado, pero no a nivel de colon.
La expresión de CyP2C24, en cultivo primario de macrófagos peritoneales de rata tratados con Aspirina 5mM, comparado con EHSI a dosis altas 200g/mL y Aspirina 5mM en distintos tiempos 6, 12 y 24 horas de incubación, nos muestran un comportamiento similar entre sí, atribuyéndose el efecto en la expresión de CyP2C24 a la Aspirina, y a los metabolitos encontrados en el extracto hidroalcohólico que pudieran estar ocasionando a esas concentraciones, efectos tóxicos.
Existen evidencias que demuestran que una larga lista de flavonoides que también se encuentran como componentes del EHSI, tienen actividad inhibitoria del Cyp2C24.143
La homología del sistema enzimático Citocromo P450 2C24 de rata, es consistente con el sistema enzimático Citocromo P450 2C19 humano, compartiendo 74% de su secuencia, con P450 2C9 hay menos correlación, mucho menos con P450 2C8.143
En los macrófagos peritoneales de rata Sprague Dawley, la expresión del Citocromo P450 2E1, no es detectada, al incubar las células en contacto con Aspirina o EHSI más Aspirina, en las condiciones trabajadas en el laboratorio, llegando a la conclusión, que su ausencia indicaría que los componentes de EHSI en combinación
con Aspirina y la Aspirina sóla, no inducen este citocromo. Esta apreciación sólo es válida para macrófagos peritoneales Sprague Dawley, puesto que difiere con los macrófagos de la línea J774.2, en donde la actividad de P450 2E1,147 por efecto de
lipopolisacáridos más Aspirina es incrementada, sin embargo, no por el lipopolisacárido sólo, en nuestro caso, no podemos demostrar si algún componente de Sacha Inchi o Aspirina a otras dosis, participan en la inhibición de la expresión de P450 2E1, debido a que el citocromo, no muestra una expresión de forma constitutiva en estas células.
Los Citocromos P450 3A2, no están expresandos en los macrófagos, por efecto de los componentes presentes en el EHSI en presencia de Aspirina, ni en el sistema de Aspirina sóla, en las condiciones de trabajo experimentadas. Citocromo P450 3A2, ha sido correlacionado con P450 3A4 hepático humano.148 sin embargo, no podemos
asegurar que los resultados sean reproducibles en humanos.
Los transcriptos del citocromo P450 4A1, fueron hallados en los macrófagos luego de la inducción con EHSI más Aspirina, a pesar que el comportamiento de su expresión no guarda una tendencia de tiempo ni de concentración, por lo que fue evidente que otros factores estaban afectando su síntesis.
Los citocromos P450 de la subfamilia 4A, metabolizan ácido araquidónico en HETEs, estos genes son inducidos por algunos fármacos como clofibrato y citoquinas proinflamatorias asociadas al asma, interleukina 1- (IL-1beta).149 Al probar la
capacidad de IL-1beta o IL-6 para modular el nivel de ARNm de PPAR alfa, se descubrió que la expresión de CYP4A1 está regulada negativamente a un nivel pretraduccional por IL-1beta y IL-6, estas citoquinas reducen la actividad 12-laurato hidroxilasa relacionada con CYP4A1 en hepatocitos de rata fetal cultivados después de la inducción con ácido clofíbrico. Se ha demostrado que el receptor activado por el proliferador de peroxisoma alfa (PPAR alfa) media la inducción del gen CYP4A1 por un proliferador de peroxisoma.149
Comparando los resultados en otros estudios realizados por el equipo de trabajo ADN-Uchumayo, en macrófagos peritoneales de rata Sprague Dawley, destinados a determinar la expresión de Interleucina 1-y la enzima Oxido Nítrico Sintasa, bajo el estímulo de extracto hidroalcohólico de Sacha Inchi más Aspirina, trabajados en las mismas condiciones de los tratamientos del presente trabajo, demostraron que la expresión de IL-comparado con la expresión de Citocromo P450 4A1, guardan una relación inversa.
La inducción en la expresión de los Citocromos P450, en los sistemas estudiados por efecto de EHSI a 10, 100 y 200g/ml, a las 6 horas de incubación, nos muestran que CyP1A1 se expresa a 100 g/ml de EHSI, lo que no ocurre con Aspirina sola. CYP4A1 se expresa a partir 100 hasta 200g/ml de EHSI, concentración inferior 10g/ml, muestra una inhibición en la expresión de este citocromo.
La expresión de CYP2E1 Y CYP3A2, no es afectada por EHSI, independiente de la dosis y del tiempo de incubación. La expresión de CYP2C24, es muy pobre a 200g/ml de EHSI.
A las 12 horas de incubación los CYP1A1, CYP2C24, CYP2E1, CYP3A2, no son expresados, mientras que la expresión de CYP4A1 es inhibida por acción de EHSI a 100 y 200g/ml, lo que no sucede con dosis de 10g/ml. Tiempos mayores hasta 24 horas, permiten incrementar la expresión de CYP4A1, por el contrario, la expresión de CYP2C24 es inhibida. Los CYP1A1, CYP2E1, CYP3A2 no son expresados por EHSI a las 24 horas de incubación. Solo CYP2C24 y CYP4A1, son expresados por efecto de Aspirina 5mM.
La inducción de P450 generada por el consumo frecuente de Sacha Inchi, puede afectar la farmacocinética, debido a que los citocromos P450, P450 1A1, 2C24 y 4A1 se inducen por efecto del extracto hidroalcoholico de sacha inchi, es absolutamente necesario evaluar el efecto en las isoformas P450, por los componentes presentes en el extracto hidroalcohólico en forma aislada.
Mostramos que mientras la expresión de CYP2E1 y CyP3A2, no es afectada por los componentes del EHSI, preocupa sobre manera la inducción de CyP1A1, por su contribución en la activación de procarcinógenos, así como la respuesta de individuos asmáticos consumidores habituales de Sacha Inchi.
La actividad de Citocromos P450 1A1 también fue incrementada en macrófagos
murine, tratados con la mezcla de lipopolisacárido y Aspirina, pero no lipopolisacárido sólo.150 Por el contrario los macrófagos peritoneales Sprague Dawley no incrementan la
expresión de Citocromos P450 1A1 al contacto con Aspirina, pero si lo hacen cuando EHSI se combina con Aspirina.
Tanto Aspirina, como el extracto hidroalcohólico de Sacha Inchi, muestran un comportamiento particular en la expresión de cada uno de los Citocromos estudiados, diversos factores tanto intrínsecos, como extrínsecos, condicionan los niveles de CYP, el manejo de las variables de concentración, tiempo y pH, podrían explicar las notables
diferencias que en ocasiones se observan en el metabolismo de fármacos, justificando las alteraciones en la respuesta farmacológica, así como las diferencias epigenéticas individuales que diferencian la susceptibilidad a la acción de tóxicos o carcinógenos.
Debido a que los CyP catalizan procesos celulares múltiples, es posible la interacción entre metabolitos sean substratos del mismo P-450 en nuestro caso Aspirina en dosis única de 5mM y los varios componentes del extracto hidroalcohólico de Sacha Inchi, entre los que destacan los polifenoles, compiten por su unión al Citoccromos P450 interfiriéndose mutuamente, sin embargo, en todos los casos el balance es impulsando la inducción de los Citocromos P450, exceptuando el efecto en la expresión de Citocromos P450 2E1 y 3A2 cuya síntesis por efecto del EHSI y Aspirina no es activada, muestra que Citocromos P450 2C24, 1A1, requiere ciertas condiciones posiblemente de pH, para inducir sus síntesis, mientras que la expresión Citocromos P450 4A1 parece obedecer a una respuesta inversamente relacionada con la expresión IL-148
Nuestros resultados alertan sobre el consumo continuado de SI, por el peligro que representa la inducción de CyP1A1, reconocido por participar en la activación de procarcinógenos de estructuras aromáticas policíclicas.150
Nuevas evidencias nos hablan de la capacidad protectora de bajas concentraciones de Aspirina para proteger varios tipos de cáncer, especialmente de colon, estómago, esófago y garganta,151 nuestros resultados muestran que Aspirina no
induce la expresiónde P450 1A1. Al parecer los flavonoides que están contenidos en EHSI podrían participar en la inducción de CyP1A1, colocando al consumidor de este complemento alimenticio a un mayor riesgo de desarrollar determinados tipos de cáncer, en tejidos extrahepáticos. 150
La inducción “in vitro” de las formas CYP evaluadas en cultivo primario de macrófagos, como se muestran en resultados, para isoformas CYP CYP1A1, CYP2C24 y 4A1 de ratas, evaluando la inducción de transcriptos mRNA, determinados a través de la reacción en cadena de la polimerasa por transcriptasa reversa, en nuestro estudio nos permite por primera vez mostrar estos resultados, en un modelo celular obtenido del cultivo primario, que no tiene la sobre carga hormonal por género y está capacitado para regular mecanismos de expresión genética. La expresión de CyP, obedece al conjunto de componentes solubles encontrados en el extracto de Sacha Inchi, los cuales no han sido caracterizados.
Los Citocromos P450 2C24 en cultivo celular primario de macrófagos peritoneales de Rattus norvegicus variedad Sprague Dawley, nos son citocromos
constitutivos, es inducido Aspirina sola, y con el pre-tratamiento con extracto hidroalcohólico de Plukenetia volubilis Linneo 200g/ml y posterior tratamiento con Aspirina 5mM. Concentraciones elevadas del extracto hidroalcohólico, son compatibles con muerte celular.
Los Citocromos P450 2E1, en cultivo celular primario de macrófagos peritoneales de Rattus norvegicus variedad Sprague Dawley, no son citocromos constitutivos, además no es inducido Aspirina sola, ni con el pre-tratamiento con extracto hidroalcohólico de Plukenetia volubilis Linneo y posterior tratamiento de Aspirina.
Los Citocromos P450 3A2, en cultivo celular primario de macrófagos peritoneales de Rattus norvegicus variedad Sprague Dawley, no son citocromos constitutivos, además no puede ser inducido por Aspirina sola y el pre-tratamiento de extracto hidroalcohólico de Plukenetia volubilis Linneo, y posterior tratamiento de Aspirina.
Los Citocromo P450 4A1, en cultivo celular primario de macrófagos peritoneales de Rattus norvegicus variedad Sprague Dawley, no son citocromos constitutivos, pero si puede ser inducido por Aspirina sola, y el pre-tratamiento con extracto hidroalcohólico de Plukenetia volubilis Linneo y posterior tratamiento con Aspirina.
Los CyP1A1, CYP2C24 y CyP4A1, son inducibles en macrófagos peritoneal, de rata; la expresión de CyP1A1 no es inducido por Aspirina, pero si por EH de SI, la expresión de CyP2C24 y CyP4A1 es inducida por Aspirina y también por EHSI, en el caso de CyP2C24, sólo es expresado a elevada concentración del EHSI, compatible con muerte celular por estrés celular.
Los CyP inducidos por Aspirina: CyP2C24 y CyP4A1; así como los inducidos por un consumo cotidiano de Sacha Inchi: CyP1A1 y CyP4A1, pueden influir en el metabolismo de otros sustratos.