La separación cromatográfica se realizó en una columna Phenomenex de fase CN, tamaño de partícula 3 µm, 4,6 mm de diámetro interno y 75 mm de largo. La fase móvil utilizada fue acetonitrilo:agua (20:80), trabajando en modo isocrático a un flujo de 100 µl/min. La columna se mantuvo a 30ºC, mientras que las muestras en el auto sampler se mantuvieron a 10ºC. El volumen de inyección de la muestra fue de 20 µl, el tiempo de corrida cromatográfica fue de 8 min y el tiempo de retención para FOS fue de 6 min.
1.j) Análisis estadístico
Los resultados fueron analizados por test t Student´s y los p valores fueron calculados utilizando el software estadístico InfoStat. Los valores promedios representaron las mediciones por triplicado de tres experimentos independientes. Las diferencias significativas entre las células tratadas con FOS y las células tratadas con FOS y DON fueron consideradas cuando se obtuvo un p< 0,05.
2. RESULTADOS
La muerte celular no fue observada en ninguno de los tratamientos luego de 24 h de incubación para ambas líneas celulares. La figura 5 corresponde a la línea celular HEp-2 que recibió diferentes tratamientos y no presentó diferencias estadísticamente significativas en el porcentaje de viabilidad celular (p> 0.05). El promedio de la concentración celular en cada pocillo de las placas de cultivo HEp-2 fue de 1,2x106 células/ml y para las células IPEC-J2 fue de de 0,9x105 células/ml.
35
Figura 5. Promedio de la viabilidad celular ± el error estándar de la media correspondiente a los distintos grupos experimentales en células HEp-2.
Las concentraciones del antibiótico intracelular en las placas de cultivo HEp-2 incubadas con 130 µg/ml de FOS cálcica, fluctuaron entre 0,4 y 1,12 µg/ml en los distintos tiempos de incubación. Se observó que el antibiótico ingresó y salió de las células en forma continua, alcanzando la concentración máxima (Cmax) de 1,12 µg/ml a un tiempo (tmax) de 8 h (figura 6).
Menos del 1% del antibiótico incubado con las células HEp-2 logró ingresar a dichas células; permaneciendo en mayor proporción en el espacio extracelular. La sumatoria de las concentraciones obtenidas de FOS intracelular y extracelular para cada tiempo de incubación, coincidió con la concentración inicial del antibiótico (130 ppm) que se incorporó a los cultivos celulares (figura 7).
Figura 6. Concentración intracelular de FOSen células HEp-2 correspondiente a placas de cultivo incubadas con 130 µg/ml FOS cálcica.
CON TR OL DON FO S DON +FO S 0 20 40 60 80 100 % v ia b il id a d c e lu la r 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Tiempo (h) C o n c e n tr a c ió n (u g /m l)
36
Figura 7. Concentración intracelular y extracelular de FOS (log10 µg/ml) en células HEp-2 correspondiente a placas de cultivo incubadas con 130 µg/ml FOS cálcica.
No se observaron diferencias estadísticamente significativas (p> 0,05) en la concentración intracelular del antibiótico entre las células HEp-2 incubadas únicamente con FOS y las células incubadas con FOS y DON. Cuando las células HEp-2 fueron incubadas con antibiótico y micotoxina, la Cmax de FOS intracelular se mantuvo entre 0,3 y 1,10 µg/ml durante
las 24 h de incubación. El Cmax deFOS fue de 1,10 µg/ml con un tmax de 12 h (figura 8 y 9).
Figura 8. Concentración intracelular de FOS en células HEp-2 correspondiente a placas de cultivo incubadas con 130 µg/ml FOS cálcica y 1 µg/ml DON.
0,10 1,00 10,00 100,00 1000,00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Tiempo (h) C o n c e n tr a c ió n (u g /m l)
FOS INTRACELULAR FOS EXTRACELULAR
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Tiempo (h) C on c e n tr ac ión ( u g/ m l)
37
Figura 9. Concentración intracelular y extracelular de FOS (log10 µg/ml)correspondiente a placas de cultivo incubadas con 130 µg/ml FOS cálcica y 1 µg/ml DON.
Por otro lado, las placas de cultivo celular IPEC-J2 incubadas con antibiótico y las placas incubadas con antibiótico y micotoxina presentaron diferencias estadísticamente significativas (p< 0,001) (figura 10). Las células IPEC-J2 incubadas con 580 µg/ml FOS cálcica presentó un Cmax del antibiótico intracelular de 45,81 µg/ml con un tmax de 4 h. Después de este tiempo, la
concentración del antibiótico intracelular decreció a 23,48 µg/ml a las 24 h de incubación. La droga se acumuló lentamente en el interior de las células IPEC-J2 y sólo el 7,89% del antibiótico que se incubó al comienzo del ensayo logró ingresar al interior de las células. La mayor parte del antibiótico permaneció en el fluido extracelular. Cuando las células IPEC-J2 fueron incubadas con 580 µg/ml FOS y 1 µg/ml DON, el Cmax del antibiótico intracelular fue de 20,06 µg/ml con
un tmax de 30 min. Para este grupo de células, la concentración intracelular alcanzada por el
antibiótico correspondió al 3,46% de la concentración de FOS utilizada al comienzo del ensayo.
Figura 10. Concentración intracelular de FOS en células IPEC-J2 expuestas a FOS o a la combinación de FOS y DON durante 24 h.
0,10 1,00 10,00 100,00 1000,00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Tiempo (h) C o n c e n tr a c ió n (u g /m l)
38
3. DISCUSIÓN
Los cultivos de células HEp-2 e IPEC-J2 constituyeron una herramienta útil para evaluar in vitro la proporción del antibiótico que ingresaría a las células respiratorias y entéricas, respectivamente. A pesar de que la línea celular HEp-2 deriva de tejidos humanos, se considera un modelo representativo debido a su origen respiratorio y ha sido ampliamente utilizado para el estudio de patógenos respiratorios que afectan tanto a humanos como animales (Roblin et al., 1992; Reddy y Kumar, 2000; Reddy y Hayworth, 2002).
El método de exclusión con azul de Tripán demostró que no se observaron efectos tóxicos en condiciones in vitro cuando ambas líneas celulares fueron incubadas con 1µg DON/ml, no existió muerte celular luego de 24 h de incubación de las células con la micotoxina. Esta concentración de DON no citotóxica utilizada en los estudios in vitro puede ser extrapolada a condiciones in vivo y ajustada a la concentración de 1 mg/kg de DON recomendada por la Unión Europea en la alimentación completa o complementaria en cerdos (Anonymous, 2006; Bergsjo et al. 1993). Nuestros resultados sobre la viabilidad de las células IPEC-J2 en presencia de DON coinciden con lo observado por Vandenbroucke et al. (2011), quienes demostraron que la concentración de 1µg DON/ml no fue citotóxica para las células IPEC-J2 diferenciadas. Otros autores han demostrado que las altas concentraciones de DON reducen la viabilidad de las células epiteliales del intestino porcino (Dänicke et al., 2010; Diesing et al., 2011a; Diesing et al., 2011b).
En nuestro estudio se demostró que una baja concentración del antibiótico ingresó al interior de las células. Esta concentración representó el 1% y el 7,89% del antibiótico incubado inicialmente con las células HEp-2 e IPECJ-2, respectivamente, en ausencia de la micotoxina. La presencia de FOS en el interior celular ha sido poco estudiado, sólo en las células polimorfonucleares humanas (Höger et al., 1985) y en las bacterias (Kahan et al., 1974). Es bien conocido que los antibióticos altamente liposolubles son capaces de penetrar en forma pasiva las membranas celulares (Mandell, 1973; Johnson et al., 1980). En relación a ello, la naturaleza hidrosoluble que presenta FOS dificultaría el ingreso de la molécula a las células por difusión pasiva (Traub, 1983; Höger et al., 1985; Trautmann et al., 1992; Gobernado, 2003; Popovic et al., 2010). Por consiguiente, la presencia de FOS en el interior de las células podría ser explicada a partir de un mecanismo activo de transmembrana. De acuerdo a los datos bibliográficos, los transportadores que utiliza FOS para ingresar a las bacterias son el que transporta el L-α-glicerol- fosfato y el que lleva a la D-glucosa-6-fosfato al interior de la célula bacteriana (Kahan et al., 1974; Gobernado, 2003; Popovic et al., 2010). Otro mecanismo activo de transporte descripto es
39
el que utiliza FOS para absorberse a nivel intestinal (Ishizawa et al., 1990, Ishizawa et al., 1991a; Ishizawa et al., 1991b; Ishizawa et al., 1992) y, por ende, el transporte que podría haber utilizado FOS para ingresar a las células IPEC-J2. Dicho transporte activo es mediado por carriers Na+-fosfato dependiente (NaPi-II) que se localizan principalmente en yeyuno y son
menos activos en íleon (Tamai y Tsuji, 1996; Steffansen et al., 2004). La diferencia de las concentraciones intracelulares de FOS obtenida en ambas líneas celulares podría atribuirse a la presencia de los transportadores de fosfato en las membranas de las células IPEC-J2 y a la falta de dichos transportadores en las células HEp-2. A su vez, existen estudios que demuestran que los carriers NaPi-II son saturables a concentraciones superiores 1 mM FOS. Es posible que en el
caso de las células IPEC-J2 se haya producido la saturación de los mencionados carriers por exponer las células a una concentración de 580 µg/ml FOS, superior a 1 mM.
Estos hallazgos revisten importancia desde el punto de vista práctico para evaluar la forma en que el antibiótico FOS se administra a los animales en los sistemas productivos. Teniendo en cuenta la localización de los carriers NaPi-II, la absorción de FOS se limitaría a las
porciones proximales del intestino delgado. A su vez consideramos que si la administración oral de FOS se efectúa en forma de bolo, una importante dosis del antibiótico se eliminaría por las heces. Esto sería producto de la saturación de los carriers y del tiempo de residencia de la digesta intestinal en el sitio de absorción que es relativamente corto en el cerdo (3-4 h) (Davis et al., 2001). La dosificación oral de FOS en el agua de bebida debería ser considerada como la correcta administración oral ya que el animal podría ingerir concentraciones pequeñas del antibiótico a lo largo del día (teniendo en cuenta la ingesta fisiológica del agua) y se evitaría la saturación del carrier NaPi-II.
Nuestros resultados indicaron que DON interfirió en la penetración de FOS a las células IPEC-J2 pero no afectó la penetración del antibiótico a la línea celular HEp-2. A pesar de no haber demostrado que DON modifica la actividad del transportador NaPi-II que utiliza FOS para
ingresar a las células, los resultados sugieren que bajas concentraciones intracelulares de FOS en presencia de la micotoxina podrían ser atribuidos al efecto del DON sobre estos mecanismos.
Las concentraciones de FOS que fueron observadas en ambas líneas celulares le permitirían ejercer su actividad bactericida contra microorganismos intracelulares, debido a que dichas concentraciones superan los valores aceptables de CIM90 para la mayoría de los patógenos
de importancia en producción porcina. En el estudio de líneas de cultivo celulares IPEC-J2, las concentraciones de FOS alcanzadas en el interior de las células superan la CIM90 de 4 µg/ml para
Salmonella entérica a lo largo de las 24 h de incubación. Es importante que FOS superó los mencionados valores de CIM en las células HEp-2 (representante del sistema respiratorio) y en
40
las células IPEC-J2 (representante del epitelio intestinal) debido a que en los sistemas de producción intensiva, los problemas frecuentes en lechones post destete son las disenterías y los síndromes respiratorios (Christensen et al., 1999; Thanawongnuwech et al., 2000; Carr, 2001; Cloutier et al., 2003; Došen et al., 2007).
41
ESTUDIO II OBJETIVO
Estudiar el efecto interactivo del deoxinivalenol sobre la penetración de fosfomicina en explantes intestinales
1. MATERIALES Y MÉTODOS
1.a) Cultivo de explantes intestinales
El estudio se desarrolló de acuerdo a las normas de aprobación ética otorgadas por el comité de Bienestar Animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires, Argentina. Para este ensayo se trabajó con cuatro lechones de destete (25-28 días de edad), clínicamente sanos. Luego del sacrificio de los animales, el intestino delgado (yeyuno proximal) fue extraído en forma inmediata y el contenido intestinal fue removido con solución fisiológica. Las muestras fueron transportadas en forma refrigerada (2- 4ºC) al laboratorio de Toxicología de la UNCPBA. A partir de las porciones de yeyuno extraídas de cada animal, se realizaron los explantes que fueron utilizados por duplicado en los distintos tratamientos. Uno de ellos fue incubado con FOS, el segundo grupo de explantes fue incubado con FOS y DON y el tercer grupo control fue incubado con solución fisiológica. El modelo utilizado para producir cultivos de explantes intestinales fue una adaptación del método de Nietfeld et al. (1991), como lo describe Zhu et al. (1995) con algunas modificaciones. Las muestras de yeyuno fueron cortadas en fragmentos de 3 cm de longitud y abiertas a lo largo del borde mesentérico. El tejido colocado en placas de Petri de 60 mm de diámetro, fue lavado dos veces con solución fisiológica por medio de agitación continua durante un período de 10 min cada uno, con el fin de eliminar el mucus y el contenido intestinal remanente. La mucosa fue cortada en piezas circulares de 1,3 cm2 (0,1 g), las cuales fueron denominadas explantes y fueron fijados con las vellosidades hacia arriba sobre esponjas. En cada pocillo de las placas de cultivo de seis pocillos se introdujo una esponja con su respectivo explante. En el centro del pocillo de la placa de cultivo se adicionó 1 ml de DMEM con GlutaMAX™-I (Dulbecco's Modified Eagle Medium – High Glucose, Gibco®) y 1 ml de F-12 Nutrient Mixture (Gibco®). Por acción capilar, el medio cubrió las vellosidades y mantuvo viable el tejido.
42
1.b) Tratamiento de los explantes intestinales
Se llevó a cabo cuatro repeticiones (por duplicado) para cada tratamiento. Los explantes fueron expuestos a las mismas concentraciones utilizadas para FOS y DON en los cultivos celulares con IPEC-J2 correspondiente a la sección experimental I. La concentración de FOS cálcica fue de 580 µg/ml (580 ppm) (98.9% de pureza; Laboratorio Bedson S.A., Pilar, Buenos Aires, Argentina) y la concentración de DON fue de 1 µg/ml (D0156; Sigma-Aldrich®, Alemania). Los explantes correspondientes fueron incubados con 20 µl de FOS o de la combinación FOS y DON. El grupo control fue incubado con 20 µl de solución fisiológica. Los explantes intestinales tratados fueron mantenidos a 37ºC en agitación continua a tiempos preestablecidos (30 min y 1, 2, 3, 4 y 6 h) (figura 11).
Figura 11. Explantes intestinales. Porción de yeyuno (A). Porción de yeyuno abierto por el borde mesentérico y exponiendo la mucosa (B y C). Remoción de mucus y contenido intestinal remanente por
medio de agitación continua (D). Explantes sobre esponjas y en placas de cultivo (E). Incubación de explantes a 37°C y en agitación continua (F).