Mechanism of HIV entry into host cells: the prime role of gp120

3. 2. 1.- Árbol filogenético de los clones virales.

Para estudiar qué cambios genéticos eran los responsables del aumento de eficacia biológica tras los pases seriados, nos planteamos la secuenciación de los genomas completos. Se obtuvieron los genomas completos consenso de todos los clones tanto en el pase inicial como en el pase final de recuperación de la eficacia biológica, en total 22 genomas (10 de los pases iniciales y 12 de los pases finales). Los genomas completos comprenden desde el extremo 5´LTR, incluyendo la región U3, R, U5 y la secuencia leader, hasta el gen nef.

Con estas secuencias se llevaron a cabo en primer lugar los alineamientos de los genomas virales por medio del programa Clustal X (Thompson y cols 1997), y seguidamente se obtuvieron las relaciones filogenéticas de los clones (ver Figura 3.14) con el programa MEGA v3.1 por el método del vecino más próximo, tal y como se describe en Materiales y Métodos (apartado 2.3.4). Para dar valor estadístico a las diferentes ramas se realizó un re-muestreo con reemplazamiento (bootstrap) con 1000 réplicas. Como se puede observar en el árbol filogenético, cada uno de los clones se mantiene agrupado junto con sus pases y placas, con un alto valor de bootstrap (100%), indicando que no hay contaminación entre muestras y que cada linaje ha mantenido su identidad. La distancia genética promedio entre linajes es del 1%. Otro dato importante es que entre los pases iniciales y finales de cada linaje no se ha producido una gran divergencia, dado que las ramas se encuentran muy próximas. Como mostraremos en apartados posteriores, se han producido pocas sustituciones entre los pases iniciales y finales de recuperación de eficacia biológica.

Resultados D1p11 D15p11 D1p1 D2p1 D2p11 K1p1 K1p11 K2p1 K2p11 I1p1 I1p11 I5p1 I5p11 E1p1 E1p11 H1p1 H1p11 VirusS61 G2p1 G2p11 G15p11 G1p1 G1p11 HXB2 100 100 100 100 100 100 0.005

Figura 3.14. Árbol filogenético de los clones virales. El grupo externo del árbol es el virus de referencia

HXB2. El virus s61 es el virus parental del cual se obtuvieron todos los linajes virales. En rojo se destacan los valores de bootstrap.

Resultados

61 3. 2. 2.- Análisis de las sustituciones fijadas en el genoma viral entre el pase inicial y

final de recuperación de eficacia biológica.

Como hemos visto anteriormente, la mayoría de los clones virales aumentaron su eficacia biológica tras los 11 pases seriados. Estos aumentos de eficacia deberían estar correlacionados con la aparición y fijación de mutaciones en el genoma de los clones biológicos finales. Comparando las secuencias de los pases iniciales y finales obtuvimos la relación de mutaciones que habían aparecido entre pases (ver Tabla 3.3). Observamos que la media de sustituciones fijadas entre pases fue muy pequeña con un valor promedio de 1.6 mutaciones por genoma y clon. Incluso se detectaron 5 clones de los 12 estudiados (42%) que no fijaron ninguna mutación entre el pase inicial y final, los clones G1p11, I1p11, I5p11, K1p11 y K2p11. En el resto de clones biológicos la distribución de mutaciones fue la siguiente: Una mutación en los clones D1p11, D15p11, y D2p11, 3 mutaciones en el clon H1p11, 4 mutaciones en los clones G15p11 y G2p11, y 6 mutaciones en el clon E1p11. Si estudiamos el tipo de mutación fijada, podemos observar un alto porcentaje de sustituciones desde el nucleótido G al nucleótido A (ver Figura 3.15), siendo ésta una típica sustitución del VIH-1. Además, las transiciones predominan (74%) frente a las transversiones. Al analizar cuantas reversiones se habían producido, detectamos 3 en total (15% de las sustituciones), 1 tanto en el clon E1p11, como en el G15p11 y el H1p11.

Los clones D1p11, D15p11 y D2p11, fijaron una misma substitución en la región U5 de la 5´LTR en la posición 593, del nucleótido G al nucleótido T. Este dato es relevante dado que ha ocurrido en las 3 réplicas del linaje D. Excluímos la contaminación dado que se tomaron todas las precauciones posibles para evitarla, además de que existían mutaciones especificas para cada linaje viral que facilitaban la distinción entre ellos (como se observa por el alto valor de bootstrap en la Figura 3.14). Esta mutación además ya fue detectada en el trabajo previo (Yuste y cols 2005). Esta mutación es especifica de este linaje viral, dado que el resto de clones mantienen el nucleótido G, por ello podría ser interesante analizarla para futuros estudios sobre la replicación del VIH-1.

En el clon E1p11, las mutaciones que encontramos en la región codificante se localizaban mayoritariamente en el gen rev. De todas éstas, la mutación desde el nucleótido T al C en la posición 8651 (T8651C) estaba produciendo la pérdida del codón de terminación del gen rev alargando la proteína en 3 aminoácidos más. Todos

Resultados estos cambios en rev se solapaban con la pauta de lectura del gen de la envuelta, aunque en este gen los cambios eran sinónimos.

En el clon final G15p11 encontramos una acumulación de mutaciones en el gen de la polimerasa, además de una mutación que afectaba tanto al gen rev como al gen tat (A8402G), produciendo en ambos un cambio no sinónimo. En el clon final G2p11, las mutaciones se localizaban solamente en el gen pol. Observamos, que las 4 mutaciones que encontramos se localizaban dos a dos en codónes contiguos, generando cada una de estas parejas un cambio no sinónimo en aminoácidos adyacentes. Según la base de datos de los Álamos (Leitner y cols 2005) estas posiciones están muy conservadas, siendo G en vez de A la base más habitual (mayor al 99%).

Una mutación que parece interesante es la producida en el clon biológico H1p11 en la posición 7758. Esta mutación, que es una reversión, se encuentra localizada en el motivo de procesamiento de la gp160 a gp120 y gp41. Es una región compuesta de 7 aminoácidos, y el cambio que se produce podría estar implicado en recuperación de este procesamiento, que se podría haber visto mermado por la introducción del nucleótido A durante los cuellos de botella. También es destacable en este clon la recuperación de la pauta de lectura de la proteína nef, que aunque se ha descrito que in vitro es dispensable, sí que se ha observado que favorece una buena replicación viral.

35,0% 15,0% 15,0% 15,0% 10,0% 10,0% G --> A A --> G G --> T T --> C T --> A Other

Figura 3.15. Porcentaje de cada tipo de sustitución detectada en los pases finales de recuperación de

Resultados

63

Clon Número

mutaciones Localización

Cambio

base Cambio aa Valor

a D1p1 D1p11 1 U5 5´ LTR (593) G Æ T NA - D15p11 1 U5 5´ LTR (593) G Æ T NA - D2p1 D2p11 1 U5 5´ LTR (593) G Æ T NA - E1p1 E1p11 6 U3 5´LTR (255) G Æ A NA - U5 5´LTR (572) T Æ C NA - rev (8499) G Æ A R Æ Q 3 rev (8511) R T Æ C L Æ P 3 rev (8651) T Æ C STOP Æ Q env gp41(8766) T Æ A D Æ N 5 G1p1 G15p11 4 pol (3129) R A Æ G KÆ E 4 pol (4421) T Æ A D Æ E 5 pol (4842) G Æ A A Æ T 5 rev (8402) A Æ Gb T Æ A 5 tat D Æ G 4 G2p1 G2p11 4 pol RT(3144) G Æ A pol RT(3146) G Æ A E Æ Kc 4 pol RT(3147) C Æ A pol RT(3149) G Æ A Q Æ Kc 4 H1p1 H1p11 3 gag p24(1443) G Æ A M Æ I 4 env g120- gp41(7758) R A Æ G T Æ A 5 nef (8913) - Æ A Recuperación fase lectura Total 20

Tabla 3.3. Resumen de las sustituciones detectadas en los genomas virales tras 11 pases seriados. La

localización de la sustitución es en relación con el virus de referencia HXB2. NA, indica no aplicable por ser una región no codificante. R indica reversión. a _{El valor de accesibilidad indica lo diferente que es un}

Resultados

diferencias, y el 1 un cambio drástico. b Esta sustitución está produciendo un cambio de aminoácido en dos proteínas distintas. c _{Indica que ambas sustituciones están implicadas en el cambio aminoacidico.}

3. 3.- COMPORTAMIENTO DE LAS CUASIESPECIES VIRALES DE LOS