El material vegetal seco y molido (600 g) de E. pazcuarense se trabajó siguiendo la misma metodología que aquella usada para S. monardifolia. Se obtuvieron 7, 5 y 16 g, de las fracciones no polar, medianamente polar y polar, respectivamente.
Fracción no polar.
La fracción no polar se diluyó en acetona y se enfrió, para después filtrar y eliminar las grasas. El espectro de RMN 1H de dicha fracción (Fig. 32), mostró la presencia de un compuesto principal, así como señales en la región de los protones aromáticos y vinílicos para otros compuestos minoritarios.
Posteriormente, a 5 g de esta fracción se sometieron a CC empacada con sílica gel como adsorbente, eluyendo con hexano y mezclas de hexano-acetato de etilo de polaridad ascendente y finalmente con acetato de etilo.
El análisis de CCF permitió reunir 8 fracciones principales, de las cuales se obtuvo el compuesto 3941 y la mezcla de 4042 y 4143 (Figura 33), cuya identificación se hizo con base en sus datos espectroscópicos y por comparación con aquellos descritos en la literatura.
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Identificación del 5-hidroxi-6-acetil-8-metoxicromeno (39)
De la fracción eluida con hexano-acetato de etilo (9:1) de la cromatografía del extracto hexánico, se obtuvieron 4.2 mg (0.084%) de 39 como un sólido amorfo color amarillo. El espectro de RMN 1H de 39 (Figura 34) mostró una señal a δ
12.79 (OH) característica del protón del grupo hidroxilo puenteado. En δ 7.04 se observó la señal del protón aromático. A frecuencias altas se observaron dos señales dobles en 6.72 ppm (d, 7.4 Hz) y otra en 5.61 ppm (d, 7.4 Hz) que corresponden a los protones vinílicos H-4 y H-3, respectivamente. La señal del grupo metoxilo se observó en δ 3.85, mientras que la señal correspondiente al grupo acetilo se observó en δ 2.54. Por último, a campos altos se observó la señal correspondiente al gem-dimetilo alrededor de 1.51 ppm.
El espectro de RMN 13C de 39 mostró la presencia de 14 carbonos (Figura 35) de los cuales 9 corresponden a carbonos con una hibridación sp2 y 5 con hibridación sp3, de los cuales uno está unido a un átomo de oxígeno.
La asignación de las señales de RMN 13C de los átomos de carbono protonados se hizo con base en un experimento gHSQC (Figura 36). Así, tenemos que la señal del protón aromático observada a frecuencias altas en δ 7.04 (H-7) mostró correlación con la señal de 13C a δ 116.0 asignándose ésta al átomo de carbono 7. Las señales de los protones vinilicos que aparecen en δ 6.72 (H-4) y 5.61 (H-3) correlacionaron con las señales en δ 116.0 y 128.4, asignándose a los átomos de carbono 4 y 3, respectivamente. El grupo metoxilo en δ 3.85 (O-Me) mostró correlación con la señal de 13C a δ 57.2, asignándose así el carbono del metilo del grupo metoxilo. Por otro lado, el metilo del grupo acetilo cuya señal aparece en δ
2.54, muestra correlación con la señal en δ 26.3, asignándose así el carbono del metilo del grupo acetilo. Finalmente, el gem-dimetilo cuya señal aparece en δ 1.58 mostró correlación con la señal en δ 28.2.
47 OH Ar H4 H3 OMe O (Me)2
48 C=O C5 OMe C2 C4a C6 C7 C4 C3 C8a C8 (Me)2 O
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La asignación de los carbonos cuaternarios se hizo gracias a la ayuda del experimento gHMBC, (Figura 37). Las correlaciones observadas en el espectro de dicho experimento se describen a continuación: δ 1.58 (Me), 5.61 (H-3) y 6.72 (H- 4) correlacionaron con la señal en δ 78.2, pudiéndose así asignar esta señal al carbono 2; δ 12.79(OH) y 5.61 (H-3) observó correlación con la señal en 110.3 ppm, la cual se asignó al carbono 4a; mientras que las señales a δ 12.79(OH), 7.04 (H-7) y 6.72 (H-4) correlacionaron con la señal en δ 155.0, lográndose, así, asignar el C-5. Las señales en δ 12.79 (OH) y 2.54 (Ac), tuvieron correlación con la señal en 111.8 (C-6). Las señales del protón 7 y del metilo del grupo metoxilo, las cuales se observan en 7.04 y 3.85 ppm, respectivamente, mostraron correlación con la señal observada en 141.2 ppm, asignando así a C-8. Por último, el carbono 8a se pudo asignar, ya que su señal (150.3 ppm) correlacionó con las señales observadas en δ 12.79 (OH) y 6.72 (H-4).
Al hacer la búsqueda bibliográfica de este compuesto, se encontró que este ya había sido aislado como producto natural de la especie Flourensia cernua,41 donde solo se describen los datos de RMN de 1H y no se describen los datos de RMN de
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50 O O HO O 2 4 5 7 8a Ar H4 H3 OMe (Me)2 C3 C4 C7 OMe (Me)2 O O
51 O O HO O 2 4 5 7 8a Ar H4 H3 OMe O (Me)2 OH C=O C5 C8a C8 C3 C4 C6C7 C4a C2 OMe (Me)2 O
52 Tabla 9. Datos de RMN para 39.
δ1H (J Hz) δ13C HMBC 2 78.2 3 5.61 (7.4) 128.4 C-4a, C-2, (Me)2 4 6.72 (7.4) 116.0 C-8a, C-5, C-2 4a 110.3 5 155.0 6 111.8 7 7.04 113.4 C-8a, C-8, C-5, C=O 8 141.2 8a 150.3 OH 12.79 C-6, C-5, C-4a (Me)2 1.51 28.2 C-3, C-2 C=O 202.2 Ac 2.54 26.3 C-7, C-6, C=O OMe 3.85 57.2 C-8
Fracción medianamente polar.
El espectro de RMN 1H de dicha fracción (Figura 38), en el cual se observa el mismo tipo de señales que el de la parte no polar, principalmente señales del compuesto 39, así como otras menos intensas que mostraron la presencias de otros compuestos.
Se comenzó el trabajo de purificación de dicha fracción y para ello se tomaron 5 g y se sometieron a CC empacada con sílica gel como adsorbente, eluyendo con hexano y mezclas de hexano-acetato de etilo, acetato de etilo, mezlcas de acetato de etilo-metanol y finalmente metanol.
Tras el análisis por CCF se juntaron 9 fracciones principales, de las cuales, las eluidas con 9:1 y 4:1 se sometieron a CC, de la primera se lograron aislar 10 mg (0.034 %) de la mezcla de los compuestos 40 y 41, y de la segunda se obtuvieron 100 mg (0.345 %) y 4 mg (0.014 %) de 39 y 42,44 respectivamente.
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Figura 39 Derivados de cromeno aislados de la FMP de E. pazcuarense.
El análisis de la bibliografía del género Eupatotium mostró que una buena parte de los metabolitos secundarios con actividad biológica interesante habían sido aislados de los extractos polares de la parte aérea. Se decidió explorar el extracto metanólico de las flores de E. pazcuarense.
Extracto metanólico de las flores de E. pazcuarense.
Se tomaron 56 g de la flor y se trato de la misma forma que a la planta, después de la evaporación del disolvente se obtuvieron 3 g de extracto crudo.
Estos 3 g se sometieron a CC, utilizando como eluentes hexano, mezclas de hexano-acetato de etilo a polaridad ascendente y acetato de etilo, de la cual después de analizar por CCF se obtuvieron 10 fracciones principales.
De la fracción eluida con la mezcla de acetato de etilo y hexano a una proporción de 3:2 se logró aislar 3 mg (0.1 %) del compuesto 43 (Figura 40), el cual ya había sido aislado anteriormente de la especie Eupatorium glabrata.45
OH O
O OH
43
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6. CONCLUSIONES
• Los metabolitos secundarios principales de la fracción no polar de S. monardifolia son, el nuevo derivado de longipineno 7β-angeloiloxi-8α- isovaleriloxilongipin-2-en-1-ona (33) y el conocido 7β,8α - diangeloiloxilongipin-2-en-1-ona (32).
• Los metabolitos secundarios principales de la fracción medianamente polar de S. monardifolia son 32, 33, y 7β,8α -diangeloiloxilongipin-1-ona (34).
• Del tratamiento de la fracción no polar de S. monardifolia con KOH se lograron obtener los compuestos 35, 36 y 37.
• Se obtuvo el compuesto 38 por tratamiento de 35 con anhídrido acético.
• Los metabolitos secundarios principales de las fracciones no polar y medianamente polar de E. pazcuarense son los cromenos 5-hidroxi-6- acetil-8metoxi-2,2-dimetilcromeno (39), 6-acetil-2,2-dimetilcromeno (40), 7- 8-dimetoxi-2,2-dimetilcromeno (41) y 6-acetil-8metoxi-2,2-dimetilcromeno (42).
• Con base en los datos de RMN de 1H y 13C en 1 y 2 dimensiones se hizo la asignación completa de los datos de 1H y 13C de 32, 33, 35, 38 y 39.
• El análisis conformacional a nivel de Mecánica Molecular (MMFF94) seguido de TFD permitió conocer a las 13 estructuras principales que contribuyen a la población conformacional de 33.