4 Component Metadata Framework
4.3 Metadata Assisted Composition
El modelo lineal estadístico fue asociado a un diseño experimental completamente al azar con un arreglo factorial anidado y los factores bajo estudio fueron: A: técnica que tuvo 2 niveles (1)- conteo de larvas en cortes (compresión de tejido) y (2)- conteo de larvas en digestión artificial y el factor B: Infección, con 16 niveles: a)- cerdos control sano (CS), b)-cerdos control infectado (CI), c) cerdos infectados y tratados (Tx) con ABZ Fase intestinal (FI), d)- cerdos infectados y Tx IVM (FI), e)- cerdos infectados y Tx NZX (FI), f) cerdos infectados y Tx ABZ en fase muscular (FM), g)- cerdos infectados y Tx IVM (FM), h)- cerdos infectados y Tx NZX (FM), i)- ratas CS, j)-ratas CI, k) ratas infectadas, Tx ABZ (FI), l)- ratas infectadas, Tx IVM (FI), m)- ratas infectadas, Tx NZX (FI), n) ratas infectadas, Tx ABZ en fase muscular (FM), o)-ratas infectadas, Tx IVM (FM), p)-ratas infectadas, Tx NZX (FM), resultando 32 tratamientos por ensayar.
El modelo lineal asociado al diseño de tratamientos expuesto, fue de la siguiente forma:
Yijĸ+i ( k) +j( k) +ij( k)+ξijk
Donde:
Yijĸ= Valor observado en la k-esima repetición, del j-ésimo nivel del factor B(infección) para el i-ésimo nivel del factor A ( técnica) .
= Media general de todo experimento. I= Efecto del i-ésimo nivel del factor A j = Efecto del j-ésimo nivel del factor B k = Efecto de la k-ésima especie
ij= Efecto de la interacción entre el j-ésimo nivel del factor B con el I-ésimo nivel del factor A.
ξijk= Error aleatorio asociado a la k-ésima repetición del j-ésimo nivel del factor B con el I-ésimo nivel del factor A
Los animales fueron asignados aleatoriamente a cada tratamiento. El número de ratas varió entre 3 y 5, el número de cerdos no varió con una constante de 2. Las variables bajo estudio fueron: Número de larvas en tejido y en digestión artificial.
8. RESULTADOS
Se logró reproducir el ciclo vital en murinos al administrárseles 500 LI a cada animal, Con un peso promedio de 250 ±50 gr, y en cerdos, administrándole 10 LI por gramo de peso, con un peso aproximado de 22 ±5 kg.
Se analizó el efecto desparasitante en la siguiente tabla (cuadro No. 4), en donde se muestran los promedios de los resultados; De manera horizontal se observa las fases de infección, seguidas de los grupos, control sano, infectado y los infectados tratados con ABZ, IVM y NZX respectivamente. En la siguiente fila se detalla la especie, señalando con M los murinos (ratas) y con S los suinos (cerdos). En los cuadros que están organizados de manera vertical observamos las técnicas a las que se sometieron los tejidos en cuestión. En la compresión de tejido se indica como en ambas especies en control sano no se encontraron células nodrizas y en los controles infectados observamos el promedio de células nodrizas en ratas (M) fue de 18.73 y en los cerdos (S) 8.9. Como se ve, en fase intestinal donde hay menor número de larvas es en el tratamiento con IVM siguiendo el tratamiento con ABZ y finalmente con mayor número de estas el tratamiento con NZX. En cerdos en FI vemos como se presenta menor número de larvas o células nodrizas los tratados con ABZ a continuación los tratados con IVM y después los tratados con NZX. Concluyendo con esto ser más eficiente el tratamiento con IVM en murinos y ABZ en suinos. No se presenta alteración aparente en las células nodrizas en ninguno de los tratamientos, es decir, las células nodrizas presentan un patrón similar al de las infectadas sin tratamiento (Tabla No. IV).
Tabla No. IV.- promedio de resultados en modelo murino y suino.
Tratamiento Fase
Intestinal y muscular
Fase Intestinal Fase Muscular
Control sano
Control infectado
Tx ABZ Tx IVM Tx NZX Tx ABZ Tx IVM Tx NZX
Especie M S M S M S M S M S M S M S M S Compresión de tejido 0 0 18.73 8.9 3.240.0162.27 1.3114.581.71 4.940.8654.960.38517.740.385 Digestión artificial 0 0 250004750255 425 12752125437519752500 0 1750437.5 7500 250 Viabilidad con Azul tripano – – + + + + + + + + + – + + + + Técnica de H-E + + + + + + + + + + + + + + + + IDD – – + + + + + + + + + + + + + + IET – – + + + + + + + + + + + + + + Reproducción del ciclo Vital en ratas – – + + + + + + + + + – + + + +
Tx- tratamiento, ABZ-albendazol, IVM-ivermectina, H/E- Hematoxilina-Eosina, M- murino, S- suino, IDD- Inmunodifusion doble, IET- Inmunoelectrotransferencia, + positivo, – negativo.
En los resultados de la fase muscular, observamos en la figura No. 4, una compresión de tejido de murino infectado con T. spiralis, sin tratamiento farmacológico, es decir, del grupo control infectado, En los murinos tratados con ABZ, se presenta menor número de larvas o células nodrizas, siguiendo con poca diferencia los tratados con IVM y con menor efecto o mayor número de larvas los tratados con NZX. En los tratados con ABZ encontramos que en un campo observado se encuentran varias larvas alteradas, entre otras aparentemente sanas (figura No.5).
Figura No. 4.- (microscopio óptico x10) Tejido de murino del grupo control infectado, se observan las larvas viables con su capsula y la larva infectante con su forma típica en espiral.
Figura No. 5.- (microscopio óptico, x10) Tejido muscular de murino tratado con ABZ en fase muscular, observada la compresión de tejido. Se ve como la larva afectada ha perdido la forma característica, mostrando un desdoblamiento.
En suinos presentó menor número de larvas, los tratados con IVM y en igual número los tratados con NZX, presentando mayor número de larvas los tratados con ABZ. Aquí es muy importante mencionar que aunque se exhibe un mayor número de larvas, estas si presentan una alteración significante como se aprecia en las figuras No. 6 6-A, 6-B y 6-C, donde tiene un aspecto negruzco; en algunas se muestra en toda la célula nodriza y en otras solo la larva, estas se observan aparentemente necróticas. En la tratadas con IVM presentan también una alteración de tipo grasa en las extremidades de la célula nodriza (figuras No. 7-A y 7-B), pero las larvas muestran las características fenotípicas similares a las infectadas. Así mismo, las tratadas con NZX exhiben alteración, es decir, presentan un puntilleo negruzco en la colágena (figura No. 8). Es interesante observar la recuperación de larvas en la Técnica de digestión artificial y en la reproducción del ciclo vital.
Figuras No.6 (A, B y C, microscopio óptico, x 10) Tejido de suino tratado con ABZ en fase muscular, en la Técnica de compresión de tejido, se distingue el aspecto negruzco de las células nodrizas y de la larva.
Figuras No. 7 (A y B).- (microscopio óptico, x 10) Compresión de tejido de suino tratado con IVM en fase muscular, se observa la infiltración de grasa presente en los extremos de la célula nodriza.
Figura No. 8.- (microscopio óptico, x 20), Compresión de tejido de suino tratado con NZX en fase muscular, nótese como se presenta un puntilleo negruzco en la colágena que envuelve a la larva de T. spiralis.
En la Técnica de digestión artificial que es la que mostró sensibilidad al modelo estadístico con el promedio obtenido en los controles infectados., observamos este patrón la forma de las larvas infectantes que se presentaron en murinos infectados y en suinos (figura No. 9). En la fase intestinal en murinos se observó que los tratados con ABZ fueron en los que menor número de LI se recuperaron (figura No. 10), siguiendo en orden ascendente los tratados con IVM y después los tratados con NZX, en suinos mostró menor número de LI los tratados con ABZ, enseguida los tratados con NZX (figura No. 11) y finalmente los tratados con IVM (figura No. 12).
En la fase muscular de igual forma, los murinos tratados con ABZ presentaron disminución de LI, mientras que los suinos tratados con ABZ en esta fase no se recupero ninguna larva infectante, si se encontró en los tratados con IVM y se presento mayor número de larvas los tratados con NZX. Se comportaron los tratamientos de igual manera en FI y FM en murinos.
Figura No. 9.- (microscopio óptico, x 10), Larvas infectantes recuperadas de la digestión artificial de los grupos control infectado, se muestra la forma natural en espiral.,
característica de la larva.
Figura No. 10.- (microscopio óptico, x 10) Larvas infectantes recuperadas de suinos tratados con ABZ en fase intestinal, después de la digestión artificial. Se ven deterioradas pero no perdieron su infectividad.
Figura No 11.-(microscopio óptico x 10) Larvas infectantes recuperadas de la digestión artificial, de suinos tratados con NZX en fase intestinal. Se nota como las larvas aunque siguen viables han perdido su forma espiral, se muestran más laxas.
Figura No. 12.- (microscopio óptico, x 10) Larvas infectantes recuperadas de la digestión artificial, de suinos tratados con IVM en fase intestinal. Se observa también a las larvas que han perdido su forma espiral, no así, su capacidad de infectar.
Como ya se menciono en suinos, como se observa en La tabla No. 4, no se recupero ninguna LI después de la digestión artificial de todos los tejidos, como recordaran, mencionamos en el análisis de la Técnica de compresión de tejido que las células nodrizas tanto como las larvas presentaban alteraciones fenotípicas de apariencia necrótica.
Siguiendo en cantidad de LI recuperadas los tratados con NZX y finalmente los tratados con IVM. Comportándose de manera similar en fase intestinal y muscular. Presentan diferencia en el comportamiento de los resultados los murinos y los cerdos como se observa, ya que mientras que en los murinos tiene el segundo lugar como efectiva la NZX en suinos lo ocupa la IVM.
En la técnica de tinción con azul tripano es importante mencionar que el colorante difundió dentro de las células nodrizas (figura No. 13-A) y dentro de las larvas (figura No. 13-B) de los tejidos de suino en fase muscular tratados con ABZ, mostrando que no son viables y comparándolas con el tejido tratado con IVM (figura No. 14), y los tratados con NZX (figura No. 15), donde no penetro el colorante dentro de las células nodrizas.
Figuras No. 13 (A y B).-(Azul tripano, x 20). Tejido de suino tratado con ABZ en fase muscular, se puede ver como el colorante difundió hacia dentro de la célula nodriza y de la larva.
Figura No. 14.- (Azul tripano, x 20). Tejido de suino tratado con IVM en fase muscular, observado después de la
tinción con azul tripano, percibiendo como el colorante no difundió dentro de la larva.
B A
Figura No.15.-(Azul tripano, x 20)Tejido de suino tratado con NZX en fase muscular, se nota como el colorante no difundió dentro de la célula nodriza.
Todos los tejidos sometidos al experimento se les realizaron la técnica de hematoxilina-eosina encontrando patrones diferentes; Por ejemplo los tejidos control infectados (figura No. 16) como en los tratados con IVM y NZX tanto en FI como en FM en murinos y suinos presento similares características (figuras No.17-A y 17-B). Y en los tratados con ABZ de la fase muscular en modelo suino, se presentó una gran presencia de polimorfo-nucleares y restos larvales en aparente degeneración (figura No. 18) y otras con aspecto de reparación (figura No. 19).
Figura No. 16.- (Hematoxilina-Eosina, x 20). Tejido
de suino, control infectado, observado al microscopio óptico, además de la larva, se ve el infiltrado polimorfonuclear al rededor de la célula nodriza.
Figuras No. 17.- (A y B, Hematoxilina-eosina, x 20). Tejidos de suinos tratados con IVM y con NZX en fase muscular. Se muestra el infiltrado polimorfonuclear mas abundante que en el tejido control.
Figura No. 18.- (Hematoxilina-eosina, x 20). Tejido de suino tratado con ABZ en fase muscular,
se observa el gran infiltrado polimorfonuclear y la aparente necrosis de la larva infectante.
Figura No. 19.- (Hematoxilina-eosina, x 20).Tejido de suino tratado con ABZ en fase muscular. Se observa como la célula nodriza esta en franco reareglo de fibras musculares.
Las técnicas implementadas como IDD (figura No. 20) E IET fueron positivas en todas las muestras de suero tomadas después de la infección (figura No. 21).
Figura No. 20.- IDD realizada a los sueros pos-infección., en el centro con número 1 se observa el pozo donde se coloca el antígeno de T. spiralis, y en los pozos de la circunferencia marcados con el No.2, se colocó el suero pos infección donde se encuentra el anticuerpo de T. spiralis, y se observa la interacción antígeno-anticuerpo en las líneas obscuras que forman un rombo.
Figura No. 21.- IET realizadas a los sueros pos-infección de los animales tratados, en el A)observamos un corrimiento de pesos moleculares en gel y en B) transferido a papel de nitrocelulosa y vemos como se expresa el triplete característico 42, 43 y 45 kDa, de la interacción antígeno-anticuerpo de T. spiralis.
En el análisis estadístico, se realizó análisis de varianza tomando como variable dependiente el No. de larvas observadas en la compresión de tejido y las obtenidas en la digestión artificial. Tomando en cuenta los factores; Especie (ratas y cerdos), Técnica (CT y DA), y Tratamiento (control sano, control infectado, infectados y tratados con ABZ, infectados y tratados con IVM, infectados y tratados con NZX), obteniendo en total 192 casos.
El procedimiento se realizo con el multifactor de análisis de varianza, por conteo de No. de larvas en suma de cuadrados de tipo III. Se construyeron varias pruebas y graficas para determinar que factores son estadísticamente significativos con el efecto de conteo de larvas. Se realizaron interacciones entre los factores y los resultados nos dicen que tanto los efectos Especie, Técnica y Tratamiento, como las interacciones entre estos muestran un P. value de menos 0.01 que es estadísticamente significativo el conteo de LI, con un nivel de confianza de 99%.
En la grafica No. 1 (figura No. 22) se muestra la interacción entre los factores técnica y especie, donde podemos observar que la técnica de compresión de tejido no es sensible a nuestro modelo estadístico, mientras que la técnica de digestión artificial si, advirtiendo el total de larvas obtenidas en cada especie en murinos mas de 8000 y suinos menos de 2000. Grafica No. 1 Interacción Técnica-especie Técnica
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Especie Murinos Suinos 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 (X 10000) 1-C. T. 2-D. A.Figura No. 22.- Se presenta la interacción técnica-especie y vemos como la técnica de compresión de tejido no es sensible al análisis estadístico, sin embargo, la de digestión artificial si es sensible. Con un p ‹ 0.01 al comparar los tratamientos y sus interacciones.
En la figura 23 la interacción de los factores especie- tratamiento (grafica No. 2), en la línea continua (azul), observamos que los murinos tratados con NZX presentan ligeramente menos larvas que los tratados con ABZ, y con más No. de larvas y por tanto menor efecto desparasitante la IVM. En la línea discontinua (roja) que representa a los suinos, se denota mayor efectividad con los tratados con ABZ y los tratados con IVM y NZX un menor efecto de manera similar.
Grafica No. 2 Interacción Especie-tratamiento Tratamiento
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Especie Murinos Suinos -1 2 5 8 11 14 (X 1000) 1-C. S. 2-C. I. 3-ABZ 4-IVM 5-NZXFigura No. 23.- en esta grafica, se muestra el comportamiento que siguen las dos especies (murinos y suinos) ante los tratamientos, y vemos como en el caso de los murinos (línea continua-azul) se presenta menor carga parasitaria con el tratamiento de nitazoxanida y ligeramente se le acerca el comportamiento el albendazol, presentando mayor carga parasitaria y por tanto menor efecto la ivermectina, contrario el efecto en suinos (línea discontinua-roja) donde el fármaco que presento mejor efecto fue el albendazol siguiendo la ivermectina y por ultimo la nitazoxanida. Con un p ‹ 0.01 al comparar los tratamientos y sus interacciones.
En la grafica No. 3 (figura No. 24), hace una comparación de la interacción que existe entre la técnica aplicada para el análisis de datos y los 8 tratamientos empleados, en donde como en la grafica No.1 la compresión de tejido no es sensible al análisis estadístico, sin embargo la digestión artificial si, y muestra tomando en cuenta a las dos especies (murinos y suinos) como el ABZ presento mayor efecto antiparasitario seguido por la NZX y finalmente la IVM. Realizado el análisis estadístico en el programa Stargraphics plus 2.1.
Grafica No. 3 Interacción Técnica-tratamiento Tratamiento
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Técnica C. T. D. A. -1 3 7 11 15 (X 1000)1-C.S. 2-C.I. 3-ABZ 4-IVM 5-NZX
Figura No. 24.- Aquí se muestra la interacción de los factores técnica-tratamiento donde se ve de igual manera que la figura No. 22 como la técnica de compresión de tejido (línea continua–azul) no es sensible al análisis estadístico y en resumen de los resultados de los tratamientos y las dos especies (línea discontinua-roja), nos muestra como en general se presento menor número de larvas recuperadas después del tratamiento con el albendazol, la nitazoxanida y al final la ivermectina Con un p ‹ 0.01 al comparar los tratamientos y sus interacciones.
8. DISCUSIÓN
Como ya se mencionó la Trichinellosis es una zoonosis endémica en el estado de Zacatecas y conforme pasa el tiempo se han dado nuevos casos en otros estados de la República Mexicana, por lo tanto es de vital importancia la investigación para encontrar el fármaco adecuado en etapas que para algunos pacientes pasan desapercibidas tomando en cuenta que hasta ahora no hay un tratamiento definitivo, ya que se han tratado pacientes infectados con mebendazol, no obteniendo buenos resultados como lo menciona Pozio et al., 2001. Esta es una enfermedad transmisible que no está controlada por ejemplo en Alaska en 2000 se presentaron 5 casos por el consumo de carne de oso polar, y en Estados Unidos disminuyó en las 2 ó 3 décadas pasadas atribuible a la prohibición de alimentar a los cerdos con desperdicios crudos, al procesamiento para su comercialización y a las precauciones en la forma de cocinar la carne por los consumidores, sin embargo, se han desarrollado epidemias actualmente debidas a los hábitos de consumo de los refugiados surasiáticos y otros (Arnold et al., 2001), se menciona que la prevalecía en suinos domésticos en este país es del 0.001% mientras que en China es de un 25% (Whatt et al., 2000) . En otros países como Alemania (Noeckler et al., 2001), Francia en 1975 (Martínez, 1998) e Italia (Pozio et al., 2000) y Argentina (Venturiello, 1995), se han presentado brotes recientemente.
En nuestro país anteriormente, del año 1993 al 1995 se consideraba un 4 a 15 % encontrados en autopsias y en 1997 se reportaron brotes en cerdos, pero solamente un caso de Trichinellosis humana (Lloyd, 2000). Actualmente han aumentado los casos de Trichinosis y se ha extendido a estados donde no se habían presentado antes (SSA 2002) posiblemente debido a que sigue en uso el trafico incontrolado de compra-venta de cerdos de un estado a otro, la matanza clandestina y la crianza de traspatio del cerdo que es el principal portador, sin dejar de mencionar los hallazgos realizados el año anterior en el Estado de Zacatecas, en el estudio presentado por Berumen et al 2002 realizado en lenguas de perros callejeros en donde de 60 muestras 3 resultaron positivas indicando por los hábitos de consumo del perro que la enfermedad esta en convivencia con el hombre.
En nuestro estudio se logró reproducir el ciclo vital de igual forma como lo menciona (Reveles et al 1999).
Cuando la infección pasa a su etapa sistémica y después a la muscular donde las larvas se depositan en fibras de músculo estriado, son causantes desde mal funcionamiento físico, dolores musculares y articulares intensos (Fragoso et al 1981; Martínez, 1998; Arnold, 2001) que como consecuencia contribuyen al bajo rendimiento en general de la persona afectada. En los murinos y suinos que se mostraron en el estudio presentaron los signos característicos atribuibles a la enfermedad como ya se mencionó pelo hirsuto, temperatura arriba de 38 ºC, dificultad y disminución de la movilidad y diarrea característica de la respuesta celular a la infección, controlada por la respuesta inmune en el huésped (Krco C. J. et al 1983). A la electroforesis presentaron el triplete característico de T. spiralis que oscila entre 42, 45 y 48 kDa (Venturiello S. 1995) siendo el mas marcado el de 43 kDa ( Del Rio y col 1986 y Despommier D. 1998).
El antígeno soluble total presentó una concentración proteica de 2.7g/ml,
indicando una buena concentración para la realización de las técnicas indirectas como IDD e IET, al mostrar los resultados obtenidos encontramos que mientras en la técnica de IDD presentó negatividad en el suero de algunos murinos infectados con 500 LI, tratados con ABZ, y algunos tratados con IVM, mientras que en la IET, todos los sueros de los animales después de la infección y hasta el sacrificio resultaron positivos, recordemos que la IDD es una prueba de baja sensibilidad mientras que la IET es sensible y específica.
Hasta ahora se han probado muchos desparasitantes como tratamiento de diferentes géneros encontrando en fase digestiva resultados favorables. En este estudio el ABZ se administró a las ratas con cánula por vía oral, esperando el efecto en su mayor parte en aparato digestivo para el tratamiento en fase intestinal, y en compañía de alimento, ya que se mejora la absorción (Abad et al 1998) es más eficaz para la fase muscular. Es importante recordar que es de los Benzimidazoles el que menos efectos adversos presenta.
Rossignol et al., 1983, muestra en estudios realizados en Europa, Este de África y Asia que el Albendazol a dosis única de 400mg muestra un alto espectro antihelmíntico quimioterapéutico apropiado en el control de grandes infecciones causadas por nematodos,. En este estudio se decidió administrar en fase intestinal la