Microstructural Observations

El alergograma o perfil alergénico del extracto del polen de olivo es heterogéneo y muy complejo [Rodríguez et al., 2001; Rodríguez et al., 2002; Batanero et al., 2010]. Hasta la fecha se han identificado, purificado y caracterizado 12 alérgenos del polen de olivo (Tabla 9), los cuales han sido denominados desde Ole e 1 hasta Ole e 12, siguiendo la nomenclatura de la IUIS (International Union of Immunologycal Societes) [King et al., 1994].

Tabla 9. Alérgenos del polen de olivo descritos.

Alérgeno MM (kDa)1 _pI2 Prevalencia

(%)3 Familia Referencia

Ole e 1 16.3/18.5* 4.8-8.0* 55-90* Ole e 1-like Villalba et al., 1993

Ole e 2 14-16** 5.1** 24 Profilina Ledesma et al., 1998a

Ole e 3 9.2* 4.3* 20-30 Polcalcina Batanero et al., 1996b

Ole e 4 32** 4.6-5.1* 80 Desconocida Boluda et al., 1998

Ole e 5 16** 5.1-6.5* 35 Superóxido dismutasa Boluda et al., 1998

Ole e 6 5.8* 4.2* 10-55* Desconocida Batanero et al., 1997

Ole e 7 9.9-10.3* ≥9* <10-47* nsLTP Tejera et al., 1999

Ole e 8 18.8* 4.5** <5 Proteína ligante de Ca+2 Ledesma et al., 2000

Ole e 9 46.4* 4.8-5.4* <10-65* 1,3-β-glucanasa Huecas et al., 2001

Ole e 10 10.8* 5.8* <10-69* CBM43 Barral et al., 2005

Ole e 11 39.4** 6.3-9.3* 56-77* Pectin metilesterasa Salamanca et al., 2010

Ole e 12 36** 4.9-5.6* 8-33* PCBER Castro et al. [2006]

1_{MM, masa molecular determinada mediante espectrometría de masas (*) o PAGE-SDS (**). Para Ole e 1 se muestran las masas}

moleculares de las formas no glicosilada y glicosilada, respectivamente.

2

pI, punto isoeléctrico determinado experimentalmente (*) o deducido de la secuencia de aminoácidos (**).

3

Prevalencia: (*) dependiente de la población.

CBM, módulo de unión de carbohidratos; nsLTP, proteína transferidora de lípidos no específica; PCBER, phenylcoumaran benzylic

ether reductase.

Los alérgenos del polen de olivo se clasifican en alérgenos principales o secundarios, según su prevalencia sea mayor o menor del 50%, respectivamente, entre los pacientes alérgicos al polen de olivo [Rodríguez et al., 2002; Rodríguez et al., 2007]. Sin embargo, la prevalencia de estos alérgenos parece ser dependiente de los niveles atmosféricos de polen y, por tanto, del área geográfica en la que vive la población sensibilizada [Rodríguez et al., 1998; Rodríguez et al., 2001; Barber et al., 2007; Quiralte et al., 2007]. En este sentido, se ha sugerido que los pacientes alérgicos de áreas con niveles de exposición extremadamente altos exhiben alergogramas más complejos en comparación con los pacientes que viven en zonas con bajos niveles de polen en la atmósfera [Rodríguez et al., 1998; Barber et al., 2007;

Quiralte et al., 2007]. A este respecto, se han descrito 45 alergogramas diferentes en el reconocimiento de 8 alérgenos del polen de olivo por 156 sueros de pacientes alérgicos de Jaén [Quiralte et al., 2007].

Dentro del extracto proteico del polen de olivo, Ole e 1 es el alérgeno más relevante y el agente de sensibilización más frecuente, mientras que otros alérgenos como Ole e 6, Ole e 7, Ole e 9 y Ole e 10, pueden ser alérgenos principales o secundarios dependiendo del área geográfica estudiada [Rodríguez et al., 2002; Rodríguez et al., 2007].

Ole e 1, ALÉRGENO PRINCIPAL DEL POLEN DE OLIVO

Ole e 1 es el alérgeno principal del polen de olivo y también la proteína más abundante en el extracto, donde representa hasta el 20% del contenido proteico total [Rodríguez et al., 2002]. El alérgeno muestra una prevalencia entre el 55% y el 90%, dependiendo del área geográfica estudiada [Lauzurica et al., 1988; Wheeler et al., 1990; Rodríguez et al., 1998]. Ole e 1 ha sido identificado como marcador de sensibilización para la familia Oleaceae [Palomares et al., 2006]. Aunque, se ha descrito que la eliminación de esta proteína del extracto supone la pérdida de casi toda la alergenicidad del mismo [Lombardero et al., 1992].

Ole e 1 es una glicoproteína de 145 residuos de aminoácidos, que exhibe un alto grado de polimorfismo [Villalba et al., 1993; Villalba et al., 1994; Lombardero et al., 1994; Hamman-Khalifa et al., 2008]. Las diferencias cuantitativas y cualitativas en Ole e 1 son las principales responsables de la distinta actividad alergénica del polen observada entre cultivares [Barber et al., 1990; Geller-Bernstein et al., 1996; Waisel & Geller-Bernstein, 1996; Boluda et al., 1999]. Esta proteína presenta un patrón complejo en PAGE-SDS, compuesto por dos bandas mayoritarias: la forma glicosilada, con una de masa molecular aparente de 20 kDa, y la forma no glicosilada, de 18.5 kDa [Villalba et al., 1993; Batanero et al., 1994b]. Además, en las preparaciones de Ole e 1 se pueden observar otras dos formas minoritarias de 22 kDa y de 40 kDa, correspondientes a la forma hiperglicosilada y al dímero de la forma glicosilada, respectivamente. Ole e 1 presenta 6 resíduos de cisteína, los cuales se encuentran implicados en la formación de 3 puentes disulfuro [González et al., 2000]. Las posiciones de las 6 cisteínas se encuentran conservadas en los miembros de la familia de proteínas homólogas a Ole e 1 (Ole e 1-like) [González et al., 2002]. Ole e 1 presenta un único sitio de N-glicosilación localizado en la Asn111 [Villalba et al., 1993; Batanero et al., 1994b; Villalba et al., 1994]. El componente N-glicosídico de Ole e 1 es heterogéneo y presenta dos glicoformas mayoritarias: una de tipo “complejo” (GlucNAcMan3XylGlcNAc2) con un residuo de β(1,2)xilosa y otra de tipo “rica en manosas” (Man7GlcNAc2) [van Ree et al., 2000]. Además, presenta una glicoforma minoritaria (5%) de tipo “complejo” que contiene un residuo de α(1,3)fucosa unido a la N- acetilglucosamina proximal [Batanero et al., 1999; van Ree et al., 2000]. Los residuos de β(1,2)xilosa y los de α(1,3)fucosa están implicados en la unión a IgE e IgG, pero no el componente “rico en manosas” [Batanero et al., 1996c; Batanero et al., 1999; van Ree et al., 2000]. De esta forma, el N-oligosacárido de Ole e 1 presenta actividad alergénica y antigénica, siendo responsable de la reactividad cruzada entre Ole e 1 y glicoproteínas no relacionadas filogenéticamente [Batanero et al., 1994b; Batanero et al., 1996c; Batanero et al., 1999; van Ree et al., 2000]. Además, el componente N-glicosídico per se es capaz de inducir la liberación de histamina de basófilos de pacientes alérgicos al polen de olivo [Batanero et al., 1999]. Los miembros de la familia Ole e 1-like presentan un sitio potencial de N- glicosilación, el cual parece conservarse entre los miembros de la misma familia taxonómica, a

excepción de BB18. Este hecho podría estar relacionado con su potencial papel en la modulación de la función biológica y la discriminación entre especies.

Ole e 1 se ha producido como proteína de fusión con la glutatión S-transferasa (GST) en la bacteria Escherichia coli, rindiendo un producto de poca calidad y con tendencia a agregar, formando cuerpos de inclusión [Villalba et al., 1994]. El alérgeno se ha producido también como proteína recombinante soluble en la levadura Pichia pastoris, con un elevado rendimiento, demostrándose su equivalencia estructural e inmunológica con el alérgeno natural [Huecas et al., 1999; González et al., 2002]. Hasta la fecha, Ole e 1 recombinante ha sido el único alérgeno de olivo usado en pruebas cutáneas con pacientes [Quiralte et al., 2000], dado que los cambios efectuados en la actual legislación española no permite el uso de estas moléculas en humanos.

Ole e 1 es el alérgeno más importante de la familia de proteínas Ole e 1-like [Mothes et al., 2004]. Los miembros de esta familia se expresan específicamente en el polen [Hanson et al., 1989; Twell et al., 1989; Villalba et al., 1994; Zou et al., 1994] y están implicados en el proceso de fertilización: hidratación del polen y/o la germinación [Muschetti et al., 1994; Alché et al., 1999; Tang et al., 2002; Johnson & Preuss, 2003; Alché et al., 2004]. Dicha función concordaría con la localización de Ole e 1 en el retículo endoplasmático rugoso, la pared celular y el tapetum, la cara exterior de la exina, el tubo polínico y en el medio de germinación in vitro [Martín-Orozco et al., 1994; Alché et al., 1999; Alché et al., 2002; Alché et al., 2004].

Otros miembros alergénicos de esta familia proteica son: Fra e 1 (fresno, Fraxinus excelsior) [Barderas et al., 2005; Barderas et al., 2006], Syr v 1 (lila, Syringa vulgaris) [Batanero et al., 1994a; González et al., 2001] y Lig v 1 (aligustre, Ligustrum vulgare) [Batanero et al., 1996a; González et al., 2001], miembros de la familia Oleaceae. Fra e 1 es un alérgeno importante en Europa central, mientras que Lig v 1 y Syr v 1 sólo son alérgenos importantes en exposición local [Liccardi et al., 1996; D’Amato et al., 1998]. Estos alérgenos muestran una identidad de secuencia con Ole e 1 mayor del 85% y son responsables, en gran medida, de la reactividad cruzada entre los pólenes de la familia Oleaceae [Batanero et al., 1994a; Batanero et al., 1996a; Martín-Orozco et al., 1994; Lombardero et al., 2002; Barderas et al., 2005]. Otros alérgenos del polen de olivo implicados en los procesos de reactividad cruzada incluyen: Ole e 2 (profilina) [Ledesma et al., 1998b], Ole e 3 (polcalcina) [Batanero et al., 1996b], Ole e 9 [Palomares et al., 2005] y Ole e 10 [Barral et al., 2004]. La reactividad cruzada es un proceso en el que las IgE específicas generadas frente a un determinado alérgeno pueden reconocer a otro diferente. La similitud estructural entre dos alérgenos es un factor crucial a la hora de mostrar reactividad cruzada, de forma que las proteínas homólogas son posibles candidatas para presentar este tipo de fenómenos. Además, la proximidad filogenética entre las fuentes biológicas de alérgenos aumenta la posibilidad de reactividad cruzada [Baugh et al., 1965; Layton et al., 1970; Leiferman & Gleich, 1976].

Otros miembros alergénicos de la familia Ole e 1-like son: Pla l 1 de Plantago lanceolata [Calabozo et al., 2001], Che a 1 de Chenopodium álbum [Barderas et al., 2002; Barderas et al., 2004], Lol p 11 de Lolium perenne [van Ree et al., 1995] y Phl p 11 de Phleum pratense [Marknell DeWitt et al., 2002]. Estas proteínas presentan escasa reactividad cruzada con Ole e 1, debido a la baja identidad de secuencia (27-33%) [van Ree et al., 1995; Calabozo et al., 2001; Barderas et al., 2002; Marknell DeWitt et al., 2002; Barderas et al., 2004]. Recientemente se ha descrito la proteína BB18 de abedul (Betula verrucosa) como un miembro no alergénico de la familia Ole e 1-like [Marazuela et al., 2012]. Además se

ha encontrado un cierto grado de identidad a través de la secuencia de aminoácidos deducida de los genes LAT52 de tomate (Solanum lycopersicum) [Twell et al., 1989], OSPG de arroz (Oryza sativa) [Zou et al., 1994] y Zmc13 de maíz (Zea mays) [Hanson et al., 1989]. Por último, proteínas con identidades de secuencia con Ole e 1 del 24% al 26% se han identificado en el polen de Phalaris coerulensces (GeneBank, número de acceso CAA74365) y Arabidopsis thaliana (AJ133639), y en la hoja de Sambucus nigra (AAF16869).

Los estudios realizados por Cárdaba et al. [1998] permitieron la identificación de dos epítopos T inmunodominantes en la molécula de Ole e 1. Éstos se encuentran localizados en las posiciones 91-102 y 109-130 de la secuencia de aminoácidos. Los primeros estudios para la identificación de los epítopos B de Ole e 1 se llevaron a cabo con anticuerpos monoclonales [Martín-Orozco et al., 1994]. Posteriormente, los estudios de González et al. [2002] empleando isoformas recombinantes de Ole e 1, anticuerpos monoclonales y sueros de pacientes pusieron de manifiesto el carácter conformacional de los epítopos B de Ole e 1. Finalmente, el uso de péptidos sintéticos solapantes sobre soportes sólidos y fragmentos recombinantes ha permitido localizar las regiones de unión a IgG e IgE [González et al., 2006]. Se han identificado 7 epítopos IgG, empleando un suero policlonal específico de Ole e 1, en las posiciones: 7-12, 29-34, 55-60, 65-70, 107-112, 119-124 y 134-142. Además, el análisis de los epítopos IgE, empleando sueros de pacientes alérgicos al polen de olivo, permitió identificar 5 regiones localizadas en las posiciones 1-18, 23-40, 43-76, 101-123 y 131-145 de la secuencia de aminoácidos [González et al., 2006]. Los datos obtenidos señalaron al extremo C-terminal, que abarca la secuencia comprendida entre los resíduos 131 y 145, como un epítopo inmunodominante, siendo la Tyr141 crítica para la unión a IgG e IgE.

La identificación de los epítopos T y B ha permitido el diseño de derivados hipoalergénicos de Ole e 1 mediante 3 estrategias: producción de mutantes, alterando o eliminando las zonas de unión a IgE (un mutante puntual -Y141A- y dos de deleción -135Δ10 y 140Δ5-) [Marazuela et al., 2007; Marazuela et al., 2008b]; producción de un híbrido entre Ole e 1 y su homólogo no alergénico BB18, OB55-58, [Marazuela et al., 2012]; y la síntesis de un péptido T, OE109-130, [Marazuela et al., 2008b]. Los estudios in

vitro e in vivo han permitido proponer a los hipoalérgenos 135Δ10 y OE109-130 como los candidatos idóneos para ser utilizados como vacunas nasales para la alergia [Marazuela et al., 2007; Marazuela et al., 2008b; Marazuela et al., 2012]. Además, el establecimiento de un modelo de ratón alérgico a Ole e 1 [Marazuela et al., 2008b] que refleja las características típicas de los pacientes alérgicos ha permitido ensayar 2 protocolos profilácticos basados en la inducción de tolerancia con vacunas nasales de hipoalérgenos libres o encapsulados [Marazuela et al., 2008a; Marazuela et al., 2008b]. Estos estudios apoyarían el uso de vacunas nasales como alternativa a la SIT convencional para el tratamiento de la alergia.

BLOQUE I. EXOSOMAS TOLEROGÉNICOS DERIVADOS DEL BALF COMO