6.6 Policy Implications
6.6.1 Minimum equity requirements
2. Evaluación de la abundancia relativa de RNAm
Los embriones utilizados para el análisis de RT- PCR fueron colectados a lo largo de dos temporadas de trabajo, entre los meses de octubre y abril. Los embriones recuperados fueron almacenados individualmente en 100 ul de TRIzol® Reagent (Invitrogen, CA,USA). El material fue preservado a -20°C para una mejor preservación de las muestras y al finalizar la temporada de trabajo se almacenaron a – 80°C hasta el momento de su utilización.
Durante la primera temporada de trabajo se recuperaron de 58 embriones (27 de yeguas jóvenes subfértiles y 31 de yeguas viejas) y durante la segunda temporada de trabajo se recuperaron 72 embriones (45 de yeguas jóvenes subfértiles y 27 de yeguas viejas). Para el análisis de RT-PCR se contó inicialmente con 72 embriones de yeguas jóvenes subfértiles y 58 de yeguas viejas.
Los embriones obtenidos fueron agrupados en viales conteniendo 5 embriones cada uno provenientes de yeguas de edades similares. Tanto el grupo de yeguas jóvenes subfértiles como el de yeguas viejas se subdividieron en 3 subgrupos cada uno en base a las edades y posteriormente se agruparon los embriones (ver tablas 6 y 7)
Figura 6: Blastocisto equino de 7 días coloreado con Alexafluor, Phalloidin Tric (filamentos de actina en rojo) y TOPRO (nucléos celulares en azul) observado en microscopio confocal Olympus IX81 a 60X
73 Tabla 6: Embriones yeguas jóvenes subfértiles
Edad de la yegua (años)
3-4 5-6 7- 10
N° embriones 25 20 10
N° grupos (n=5) 5 4 2
Tabla 7: Embriones yeguas viejas
Edad de la yegua (años)
15- 16 18- 20 ≥ 20
N° embriones 25 5 10
N° grupos (n=5) 5 1 2
Se trabajó con 11 grupos de embriones para yeguas jóvenes subfértiles y 8 grupos para yeguas viejas, a partir de los cuales se realizó la purificación de ARN para posteriormente evaluar la abundancia relativa de ARNm. Luego del procedimiento de extracción de ARN se cuantificaron los niveles del mismo mediante un picodrop y se observó que varias muestras presentaban cantidades escasas de ARN por lo que tuvieron que ser descartadas del análisis. Para el análisis de la abundancia relativa de ARNm por medio de la técnica de RT- PCR se trabajó con 5 grupos de embriones de yeguas jóvenes subfértiles y 4 grupos de embriones de yeguas viejas.
Cuantificación de los niveles de ARNm por RT-PCR en tiempo real Extracción de ARN
La purificación del ARN fue realizada mediante la utilización de las columnas de purificación Direct-zolTM RNA Mini Prep. El protocolo fue realizado según las sugerencias del fabricante.
74 Síntesis de ADN copia
Se realizó una retro transcripción (RT) a partir del ARN total obtenido en el paso anterior, el cual se utilizó como templado para sintetizar ADN copia (ADNc). Para esto se tomaron 8 µl de ARN total y se incubaron durante 1 h a 42°C con OligodT, enzima SuperScriptTMII Reverse Transcriptase (Invitrogen™, NY, USA) y RNaseOUT (Invitrogen™, NY, USA), un inhibidor de RNasas. Con estas modificaciones del protocolo original se asegura mayor eficiencia en la síntesis de ADNc. (Los reactivos y sus concentraciones finales se detallan en Anexo, tabla 2). Se realizó un control negativo de cada reacción de RT, es decir sin enzima retro transcriptasa para confirmar la ausencia de ADN genómico en las muestras.
Diseño de oligonucleótidos
Se realizó la búsqueda de la secuencia de los genes de interés en la base de datos NCBI (National Center forBiotechnologyInformation), a partir de las cuales se diseñaron los oligonucleótidos utilizando el software Primer Express® Software v3.0 (Biosystems), de manera que los amplicones tuvieran 50-100 pb de longitud tal como se recomienda para qPCR (Tabla 8). Los oligonucleótidos seleccionados poseen una temperatura de hibridación (annealing) que permite utilizar parámetros de termo ciclado universales (Tabla 8). Se utilizó la herramienta BLASTn (Basic Local AlignmentSearchTool) para confirmar que los oligonucleótidos diseñados fueran específicos para secuencia única. Adicionalmente, se comprobó la eficiencia de los pares de oligonucleótidos diseñados para los genes HSP70, BiP y PSMB5, mientras que fue necesario diseñar nuevos pares para los genes ATF-6, Bax, GAPDH y Caspasa-3, utilizando nuevamente el software Primer Express® Software v3.0 (Biosystems) (Tabla 8).
75 Gen Oligo- nucleótido Secuencia (5’-3’) Tm (°C) Amplicón (pb) Número de registro Gene bank GAPDH Forward GGTTGTCTCCTGCGACTTCA
A
59 64 NM_001034034.1
Reverse AATGCCAGCCCCAGCAT 59
Bax Forward GCGCATCGGAGATGAATTG 59 59 NM_173894.1
Reverse CCACAGCTGCGATCATCCT 58
Caspasa-3 Forward TACTTGGGAAGGTGTGAGA AAACTAA
58 71 NM_001077840.1
Reverse AACCCGTCTCCCTTTATATT
GCT
58
ATF-6 Forward AAGCTGCTCCATTTCTCACC AT 59 65 NM_001075935.1 Reverse CTTGCCTTGTGTCAGCTTCA GT 58 HSP70 Forward CCATCTTTTGTCAGTTTCTTT TTGTAGTA 58 75 NM_203322.2 Reverse GGAAGTAAACAGAAACGGG TGAA 58
BiP Forward GATTGAAGTCACCTTTGAGA
TAGATGTG 59 85 NM_001075148.1 Reverse GATCTTATTTTTGTTGCCTGT ACCTTT 58 PSMB5 Forward GCTTCTGGGAGAGGCTGTTG 59 69 NM_001037612.1 Reverse CGGAGATGCGTTCCTTGTTT 59
Tabla8: Oligonucleótidos utilizados. GAPDH: gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa. Bax: Bcl-2 associated X protein. ATF-6: Activatingtranscriptionfactor 6. HSP70: Heat shock protein 70. BiP: Immunoglobulin heavy chain binding protein. -Proteasa.
Ensayos de PCR en tiempo real
La cantidad de ADNc en cada muestra se correlaciona con los valores de ARNm presentes en los grupos de blastocistos. Se cuantificaron los niveles de ADNc mediante PCR en tiempo real usando
los reactivos comerciales SYBR® Green PCR Master Mix (AppliedBiosystems, Foster City, CA.).
Estas reacciones se llevaron a cabo en un termociclador AppliedBiosystems 7500 Real-Time PCR.
Cada reacción de PCR (volumen total 10 µl) se realizó a partir de 4 µl de ADNc diluido (dilución 1:10 de la reacción de retro transcripción de las muestras) y 6 µl de la mix de reacción. Cada muestra fue estudiada por triplicado. Los reactivos se utilizaron en las siguientes concentraciones finales: SYBR® Green PCR Master Mix1X, 0,6 µM para cada oligonucleótido de genes indicadores de estrés y 0,6 µM para cada oligonucleótido de genes controles endógenos. El protocolo de PCR incluyó un paso inicial de desnaturalización de ADNc (para eliminar estructuras secundarias) a 95°C por 10 min, luego continuó el proceso de amplificación (40 ciclos) que consistió en: 95°C por 15 seg (desnaturalización) y 60°C por 1 min (hibridación de los oligonucleótidos y extensión).
76 La PCR en Tiempo Real no solo permite la detección del producto específico de PCR, sino que también, permite monitorearlo al mismo durante la corrida. Para ello existen distintos métodos, que se basan en la utilización de fluoróforos y la detección de la intensidad de fluorescencia emitida por estos. En este trabajo se utilizó el fluoróforo SYBR® Green, que posibilita el análisis del amplicón simultáneo a la reacción de amplificación gracias a su capacidad de intercalarse con la doble hélice de ADN (Wittwer et al., 1997; Figuras 6 y 7). Esta técnica se basa en la unión inespecífica del fluoróforo a una doble cadena de ADN, lo que produce un aumento en la intensidad de fluorescencia de este colorante. El equipo detecta estas señales y se grafica el incremento de la fluorescencia en función del número de ciclos, lo que se conoce como curvas de amplificación (Figura 7). Esta técnica puede utilizarse para cuantificar una muestra de concentración desconocida mediante la comparación de la intensidad de fluorescencia registrada y la de los estándares de concentración conocida. En este trabajo el objetivo no se focalizó en un análisis cuantitativo de los niveles de expresión de los transcriptos, sino en estudiar las diferencias de expresión entre los diferentes genes.
Figura 6: Método de SYBR® Green para RT-PCR cuantitativa en tiempo real
Figura 7: Curva de amplificación de RT-PCR en tiempo real. El gráfico muestra los valores de fluorescencia emitidos durante las reacciones de PCR en función del tiempo (número de ciclos) para 4 diluciones seriadas (1x10-6, 1x10-7, 1x10-
8 y 1x10-9, y tres réplicas por dilución) de ADNc de blastocistos. En este caso se muestran las curvas obtenidas con los
77 Para cada muestra el programa informático calcula el número de ciclo en el que el lector empieza a detectar un incremento de fluorescencia significativo, con respecto a la señal de base. El umbral en el que se produce un cambio significativo en la fluorescencia se denomina threshold, y el corte entre el threshold y la curva de amplificación, determina el Ct o ciclo umbral que se emplea para la cuantificación y es inversamente proporcional a la concentración inicial de ADN blanco presente en la muestra. Cuanto más templado blanco esté presente al principio de la reacción, menos ciclos serán necesarios para alcanzar el punto en el cual la señal de fluorescencia supere la línea base o
background.
Para el análisis de expresión génica se realizó una curva estándar con el fin de obtener la pendiente de la recta decreciente, para así obtener un factor corrector en nuestra muestra de interés. Esta puede ser utilizada no solo para estudiar la expresión relativa de genes, sino también, para cuantificar una muestra de concentración desconocida con estándares de concentración conocida. Para cada par de oligonucleótidos se realizó una curva de calibración a partir de 5 concentraciones de ADNc conocidas: 1x10-5,1x10-6, 1x10-7, 1x10-8, 1x10-9, y tres réplicas por dilución (Figura 8). Dicho ADNc fue obtenido a partir un vector pUC 57 (2710pb), replicado en E.coli, el cual poseía es su sitio de clonado múltiple las secuencias correspondientes a los oligonucleótidos de interés, la figura 8 muestra un esquema del vector utilizado. Las curvas estándares promediaron una eficiencia cercana al 100%.
Figura 8: Vector pUC57 de 2710pb, utilizado para clonar las secuencias de oligonucleótidos para la posterior realización de las curvas estándar para cada gen.
78 La curva de calibración se construyó graficando los valores de Ct de las muestras de ADNc conocidas en función del logaritmo de la cantidad inicial estándar (Figura 9). De esta manera se pudo determinar la pendiente de la recta la cual fue utilizada como un valor de corrección en la amplificación de los genes.
Figura 9: Curva estándar de GAPDH construida a partir de muestras de ADNc de diluciones conocidas. Al graficar los valores de Ct obtenidos en la reacción de PCR en función de la cantidad de templado inicial (valores convertidos a logaritmo), se obtiene una recta donde pueden luego interpolarse los valores de cantidad inicial incógnita de muestras de ADNc. Una pendiente con valor -3,3 denota una óptima eficiencia de amplificación.
El parámetro R2 de la curva estándar describe la correlación entre los Ct y el logaritmo de la concentración inicial para una muestra. El rango de valores que toma va del 0 al 1, donde valores cercanos a 1 indican una buena correlación entre Ct y el logaritmo de la concentración inicial de ADNc.
Si la reacción de PCR tiene una eficiencia de amplificación óptima, una diferencia de un ciclo resulta en la duplicación del producto amplificado, es decir, para un ciclo de diferencia Qf/Qi=2, siendo Qf la cantidad final y Qi la cantidad inicial, y para dos ciclos de diferencia Qf/Qi=22 y así sucesivamente, para ―n‖ ciclos Qf/Qi=2n
, donde n=número de ciclos. Del mismo modo, diferencias de Ct entre dos muestras ―x‖ e ―y‖ responden a la ecuación Qx/Qy=2n
, donde n=Cty-Ctx. Despejando Cty-Ctx de la ecuación, surge que la diferencia entre Ct teórica para dos muestras cuyas cantidades difieren en 10 veces es de 3,3.
Pendiente: -3.26 Intersección eje Y: 22.16 R2: 0.98. Eficiencia (%): 102,70
Curva Estándar
Cantidad de muestra C t79 En este trabajo se extrapoló la concentración de cada gen en la muestra experimental a partir del Ct obtenido. Posteriormente se calculó la relación entre la cantidad del gen testeado y el gen de referencia, y se comparó dicha relación entre las muestras.
Los niveles de ADNc de los genes de interés se normalizaron respecto a los de gliceraldehído-3- fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) (gen de referencia de expresión constitutiva, cuya abundancia de transcriptos permanece estable a través del desarrollo embrionario en bovinos. Goossens et al., 2005), de manera que este trabajo se postula dicho gen como un alternativa de referencia o housekeeping (inglés), procedimiento utilizado para la corrección de las variaciones en calidad y cantidad a ARN y/o ADNc (Brocco et. al, 2003).
Como se mencionó anteriormente, el método de SYBR® Green para cuantificar ácidos nucleicos por PCR en tiempo real es inespecífico. Este inconveniente puede ser solucionado sometiendo a los productos de amplificación al protocolo de disociación final (Ririeet al., 1997). Este control consiste en elevar gradualmente la temperatura, partiendo de la temperatura de hibridación hasta 94°C, provocando la desnaturalización de los productos de PCR finales. Cuando los fragmentos de la doble cadena se desnaturalizan, el colorante se separa del ADN y se pierde la señal de fluorescencia. Detectando la fluorescencia en función de la temperatura, se observa una caída en la intensidad de fluorescencia (punto de inflexión, Figura 10a), que corresponde a la temperatura de desnaturalización media (Tm: meltingtemperature) del producto amplificado. Si se grafica la derivada de la fluorescencia respecto de la temperatura (Figura 10b) se observa un pico que corresponde a la temperatura media de desnaturalización del amplicón. Dado que cada secuencia posee un Tm único, la aparición de más de un Tm denotará la existencia de una mezcla de distintas secuencias amplificadas. Teniendo esto en cuenta, solo usamos aquellos pares de oligonucleótidos que amplifican un fragmento de ADNc único para realizar la cuantificación (Figura 10b).
80
Figura 10: Curva de disociación del amplicón del par de oligonucleótidos de GAPDH. a. La fluorescencia decae a medida que el fragmento de ADN doble cadena se desnaturaliza por efecto del calor, ya que el colorante SYBR® Green solo emite señal cuando se encuentra intercalado en la doble cadena. b. La derivada de la curva muestra un pico que corresponde a la temperatura media de la desnaturalización del fragmento de ADN. La presencia de un único pico denota la existencia de un único fragmento de ADN (más de un producto de PCR resulta en múltiples picos).
Controles
Se realizaron dos tipos de controles para todos los pares de oligonucleótidos utilizados.
El control de templado consistió en sustituir el templado de ADNc en la reacción de PCR por agua, de esta manera se verificó que los componentes de la mezcla no estuvieran contaminados con ADN. El control de amplificación consistió en omitir la enzima Retro Transcriptasa en la síntesis de ADNc, por lo tanto, si en la PCR se observaba amplificación de producto indicaría presencia de ADN genómico. Es importante que no haya otra fuente de amplificación para asegurar la especificidad de la cuantificación de ADNc.
Análisis estadístico
Se realizó un análisis estadístico de los datos con el programa InfoStat® Software Estadístico (Universidad Nacional de Córdoba, Arg.). Dado que las muestras son independientes se probó distribución normal de los datos mediante el test de Shapiro-Wilks (95 % intervalo de confianza) y se comprobó la homocedasticidad con la prueba de Levene. Se utilizó el análisis estadístico llamado ―análisis de la varianza‖ (ANOVA) de un factor, seguido del test de comparaciones múltiples
81 (Tukey) para analizar la expresión diferencial de ARNm en los distintos tratamientos. Se consideraron diferencias significativas con un p < 0,05. El n o tamaño muestral se estableció tomando como referencia los trabajos de Rizos et al., 2002; Paris et al 2010; Klein y Troedson 2011; Smits et al 2010; Canepa et al 2011; Clemente et al 2012; Gad et al 2012; Wohles-Viana et al 2012.
82
RESULTADOS
Sección Experimental I
Variables reproductivas y tasas de recuperación embrionaria en yeguas jóvenes subfértiles y viejas
1- Tasa de recuperación embrionaria
Los resultados de la primera temporada de trabajo demostraron diferencias significativas entre el grupo de yeguas jóvenes fértiles pertenecientes al sistema de transferencia embrionaria del haras y el grupo de jóvenes subfértiles (p= 0.0102), así como también con el grupo de yeguas viejas (p= 0.0015).
Tabla 6:Lavajes positivos y negativos en yeguas jóvenes fértiles, jóvenes subfértiles y viejas.
Yeguas Ciclos de Recuperación POSITIVA (%) Ciclos de Recuperación NEGATIVA(%) Total ciclos Fértiles (n=7) 25 (65,8) b 13 (34,2) 38 Subfértiles (n=10) 16 (37,2) a 27 (62,8) 43 Viejas (n=10) 10 (28,6) a 25 (71,42) 35 Total 51 65 116
En cuanto a los resultados de las tres temporadas de trabajo, las tasas de recuperación embrionaria para yeguas jóvenes subfértiles y viejas fueron 44,63% y 35,63% respectivamente. Los resultados del análisis estadístico no detectaron diferencias en las tasas de recuperación embrionaria entre los grupos de yeguas subfértiles (p=0.1230).
83 Tabla 7: Lavajes positivos y negativos en yeguas viejas y jóvenes subfértiles.
Flushing
Grupo Negativo Positivo Total
Jov. subfértiles(n=32) 98 (55.37) 79 (44.63) 177 Viejas (n=18) 103
(64.38) 57 (35.63) 160
201 136 337