Algunas de las herramientas bioinformáticas a las que recurrimos para realizar los análisis posteriores tienen como requerimiento que el alineamiento que se utilice como input sea de nucleótidos, por codones y además, debe estar en la pauta de lectura adecuada. Para cumplir estos requisitos, convertimos nuestros ficheros concatenados a aminoácidos utilizando el software Aliview 1.24
(www.ormbunkar.se/aliview). Seguidamente, utilizamos el software
MAFFT v7.310 (https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/) para llevar a cabo el alineamiento de las secuencias. Finalmente, convertimos el alineamiento resultante a nucleótidos utilizando un script de R. Para eliminar los codones stop presentes en el alineamiento se recurrió al script CleanStopCodons.bf presente en el software HyPhy (del ingés, Hypothesis Testing using Phylogenies) (http://www.hyphy.org/).
3. Árbol filogenético
Para observar las relaciones evolutivas entre las secuencias descargadas de adenovirus pertenecientes al género Mastadenovirus, se construyó un árbol filogenético. En este caso se trabajó con los ficheros de secuencias de adenovirus de genoma completo.
Utilizando un script de R, se eliminaron primero las secuencias codificantes sin función asignada definidas como hipotéticas. Seguidamente, se eliminaron las secuencias no variables, es decir las que no mostraban diferencias. Después, estos genomas únicos se concatenaron en un único fichero y se procedió a realizar el alineamiento.
Para realizar el árbol filogenético utilizamos la herramienta IQ-TREE
(http://www.iqtree.org/) mediante el método de máxima verosimilitud
introduciendo como input nuestro alineamiento en formato FASTA. Se recurrió a los comandos de -m para la búsqueda del mejor modelo de sustitución que se ajustara a nuestros datos y -bb para especificar el número de réplicas bootstrap. Los resultados obtenidos fueron visualizados y analizados utilizando FigTree v1.4.4 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/).
4. Recombinación y selección
Previamente al estudio de la presión de selección en cada uno de los genes de adenovirus, se investigó la presencia de recombinación en nuestros alineamientos. Para ello se utilizó la herramienta Genetic Algorithm for Recombination Detection (GARD) y el servidor en línea Datamonkey (https://www.datamonkey.org/).
Para calcular los ratios 𝑑𝑁
𝑑𝑆 (ω) (donde 𝑑𝑆 corresponde al número de
sustituciones sinónimas por sitio no sinónimo y 𝑑𝑁 a al número de sustituciones no sinónimas por sitio sinónimo) y determinar las presiones de selección posición por posición se recurrió a la herramienta Single-Likelihood Ancestor Counting (SLAC), también localizada en el servidor on line Datamonkey. Este método utiliza una combinación de aproximaciones de máxima verosimilitud y de conteo para calcular las tasas de sustitución no sinónimas (𝑑𝑁) y sinónimas (𝑑𝑆) en cada posición de un alineamiento dado y su correspondiente filogenia. SLAC asume que la presión de selección en cada una de las posiciones es constante a lo largo de toda filogenia.
Para llevar a cabo este análisis se utilizaron como input cada uno de los ficheros de alineamiento en formato FASTA de cada uno de las regiones codificantes por separado. Los alineamientos seguían el formato permitido por la herramienta: alineamiento de nucleótidos, en pauta y en ausencia de codones de stop.
5. Diversidad genética
La diversidad en adenovirus se estudió realizando dos aproximaciones distintas. En la primera de ellas, se estudió la diversidad a lo largo del genoma de las diferentes especies de adenovirus que conforman el género Mastadenovirus.
Después de realizar el alineamiento de secuencias, se utilizó el software DNAsp v5.10.01 (http://www.ub.edu/dnasp/) para estimar el número promedio de diferencias nucleotídicas por posición entre las secuencias. Para obtener las gráficas, se realizó un análisis por ventana deslizante (sliding window) de tamaño 200 pb y un step size de 20 pb.
La segunda aproximación consistió en estudiar la diversidad promedio en cada uno de los genes de adenovirus. Para ello, se utilizaron los alineamientos de cada una de las regiones codificantes y se estimó la diversidad promedio tanto a nivel de nucleótidos como de aminoácidos.
Para el cálculo de la diversidad nucleotídica se utilizó el software Variscan versión 2.0.3 (http://www.ub.edu/softevol/variscan/) y los alineamientos se convirtieron a formato PHYLIP. Finalmente, para el cálculo del número promedio de sustituciones de aminoácidos por posición entre secuencias, se utilizó el software MEGA versión 10.0.5
(https://www.megasoftware.net/) y el modelo de corrección de
6. Células
Las líneas celulares tumorales humanas HeLa (CCL-2) y HeLa H1 (CRL-1958), ambas de adenocarcinoma de cérvix, fueron obtenidas de la American Type Culture Collection (ATCC). La línea celular HeLa fue utilizada para la amplificación y la posterior obtención de stocks de adenovirus, mientras que las células HeLa H1, se emplearon para la estimación del título viral mediante el ensayo de titulación en placa. Por otra parte, la línea celular MRC-5 (CCL-171) (fibroblastos embrionarios de pulmón humano), también procedente de la ATCC, fue utilizada como célula hospedadora no tumoral durante la evolución experimental de adenovirus.
Estos tres tipos celulares fueron cultivados en Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado al 10 % de suero bovino fetal inactivado (FBSi), 1% penicilina- estreptomicina (P-S) y 1% fungizona (F), en condiciones de humedad relativa (95%), temperatura (37ºC) y CO2 (5%) controladas. La existencia de micoplasma se testó
mediante PCR previamente a la realización de los ensayos correspondientes y de forma rutinaria cada vez que se descongelaba una alícuota. Cuando las células alcanzaban la confluencia, se subcultivaban realizando un lavado con tampón fosfato salino (PBS por sus siglas en inglés, de phosphate buffered saline) y posteriormente, se añadía 1 ml de tripsina-EDTA 0.25%-0.02%. Tras 5 min de incubación, se procedía a inactivar la tripsina añadiendo 10 ml de DMEM completo.
En el caso de las líneas celulares tumorales, la ratio de subcultivación fue 1:2-1:10 en función de las necesidades y para las células MRC-5 de 1:2-1:6 y únicamente hasta pase 12. La criopreservación se llevó a cabo empleando DMEM completo suplementado al 5% DMSO. Los criotubos se almacenaban a -70ºC y al día siguiente en nitrógeno líquido hasta su posterior uso.
7. Virus
El HAdV5 wt (Adwt300) fue amablemente cedido por el Dr. Ramón Alemany del Instituto de Investigación Biomédica de Bellvitge (IDIBELL). El virus fue crecido en células HEK293 y posteriormente purificado mediante centrifugación en gradiente de CsCl.