MODELS WITHOUT FOLLOW UP

Nuestros datos indican un aumento significativo en la frecuencia de aberraciones cromosómicas totales inducidas por la EZ en las células ADIPO-P2 en relación con los cultivos de células sin tratamiento en todos los tiempos estudiados. Si bien las diferencias registradas en las frecuencias de aberraciones en células expuestas al buffer de citrato de sodio 0,02 N (solvente de la EZ), fueron significativas en relación a las obtenidas en las células ADIPO-P2 sin tratamiento, la frecuencia de aberraciones totales inducidas por el mutágeno aumentó significativamente en todos los tiempos postratamiento con respecto a ambos controles (cultivos sin tratar y cultivos con citrato de sodio); (Figura 19). Asimismo, al igual que en el caso de los compuestos BLM y EN, se detectó la inducción de CI y de fragmentos acéntricos como consecuencia de la acción de EZ sobre las células ADIPO-P2 pero en este caso a las 18 horas y 15 días postratamiento (Tabla 9). Estos resultados concuerdan con los obtenidos previamente por Bolzán y cols. [47] en células CHE expuestas a EZ, quienes observaron que el 34% de las metafases analizadas 18 horas después del tratamiento utilizando una concentración de 2 mM del mutágeno presentaron pares de CI y FT [47]. Teniendo en cuenta los datos obtenidos con los mutágenos estudiados en este trabajo y observaciones previas realizadas por otros investigadores [46], [47], [92], podemos concluir que la formación de CI constituye uno de los eventos más comunes luego de la exposición a mutágenos químicos. Asimismo, nuestros resultados indican que el citrato de sodio si bien no induce citotoxicidad, ejerce cierto grado de genotóxicidad sobre los telómeros de los cromosomas, ya que el daño cromosómico observado se manifiesta como aberraciones que involucran disfunción telomérica, algo previamente desconocido, ya que requiere del uso de la técnica de FISH con sonda telomérica para ser detectado y esta Tesis es el primer trabajo donde se aplica esta técnica en células tratadas con citrato de sodio. No obstante, puede mencionarse que existe al menos un trabajo publicado donde se señala que el citrato de sodio puede ser citotóxico [141]. Además, es importante destacar que en ninguno de los trabajos previos realizados con EZ en células CHO en el Laboratorio de Citogenética y Mutagénesis del IMBICE, se encontró un efecto cito- y/o genotóxico del

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citrato de sodio [47], [95] y que el citrato de sodio es el solvente por excelencia para disolver a la EZ [82], [83].

En concordancia con otros trabajos previos [142]–[144], la EZ no indujo unicamente aberraciones de tipo cromátida (como la mayoría de los mutágenos químicos) en la primera división mitótica luego del tratamiento, sino también aberraciones de tipo cromosoma (Tabla 10). Nuestros resultados indican que este efecto también se mantiene a largo plazo, a los 10 y 15 días postratamiento con EZ. Además, la EZ indujo principalmente aberraciones que involucran disfunción telomérica (Tabla 11) en todos los tiempos estudiados. La disfunción telomérica se manifestó principalmente por la pérdida y duplicación de señales teloméricas de tipo cromátida y cromosoma, aunque también se observaron señales teloméricas adicionales, señales teloméricas extracromosómicas y translocación de señales teloméricas (Figura 20). De este modo puede decirse que, este tipo de aberraciones directamente relacionadas con la disfunción del telómero, también es consecuencia del efecto de compuestos con propiedades alquilantes (como la EZ) sobre células de mamífero.

Por otro lado, si bien las mediciones de la longitud telomérica obtenidas a las 18 horas luego del tratamiento indican que hubo una diferencia significativa entre las células tratadas con el buffer de citrato de sodio y las células control (sin exposición), se indujo un mayor aumento en el número de repeticiones teloméricas en la progenie de células expuestas a EZ. Este efecto se mantuvo hasta los 10 días después del tratamiento (Figura 25 y Figuras complementarias 4 y 5 A-F del Anexo I de Resultados). Sin embargo, los datos obtenidos para la enzima telomerasa señalan que, si bien hubo una disminución en la actividad de la enzima a las 18 horas postratamiento, la actividad telomerásica en las células ADIPO-P2 control y aquellas células expuestas al mutágeno resultó extremadamente baja, con valores muy cercanos a los obtenidos con la línea Saos2 (con actividad de telomerasa muy baja o deficiente); (TPG<1-300). Asimismo, no se detectó la inducción de la actividad de la enzima en ninguno de los tiempos estudiados (Tabla 12). Los registros de la actividad de la telomerasa obtenidos a corto plazo, difieren de aquellos indicados por Quiroga y cols. [95] en células CHO, quienes demostraron que no existen variaciones significativas en la actividad de la enzima a las 18 horas postratamiento con EZ en relación a las células control. Esto demuestra que la sensibilidad de la droga sobre la telomerasa varía de acuerdo al tipo celular expuesto al antibiótico [74], [95]. Sin embargo, nuestros datos concuerdan con aquellos informados por González-Suárez y

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cols. [145], quienes a partir de un modelo murino deficiente en actividad telomerásica, estudiaron la sensibilidad citotóxica y el impacto de la inhibición de dicha enzima, en respuesta al tratamiento con otro agente con propiedades alquilantes, el N-metil-N- nitrosourea (MNU). Las generaciones de ratones más tempranas (G1 y G2), provenientes de ratones deficientes en telomerasa, carecían de actividad de la enzima, pero aún presentaban telómeros largos. Recién a partir de la quinta generación de ratones (G5), se registró una pérdida significativa de repetidos teloméricos. Además, el acortamiento telomérico que se registró a largo plazo en dichos ratones, estuvo acompañado por un aumento significativo en la cantidad de CI y en la frecuencia de fusiones teloméricas [145]. Asimismo, nuestros datos obtenidos a largo plazo mostraron que a los 15 días postratamiento la longitud telomérica disminuyó en las células tratadas con EZ, (Figura 25 y Figura complementaria 6 A-F del Anexo I de Resultados) respecto de las células control. De este modo, cuando la actividad de la enzima telomerasa es extremadamente baja o bien se encuentra inhibida, el acortamiento telomérico se hace evidente varias generaciones después del tratamiento con el agente mutagénico. En efecto, los ratones que tienen telómeros muy cortos presentan una hipersensibilidad al tratamiento con aquellos agentes que ocasionan rupturas de cadena en el ADN, como la radiación ionizante [145], los agentes alquilantes (MNU) [146] y la BLM [132], (ver sección 6.1 de la Discusión). Por otro lado, nuestros datos también concuerdan con aquellos informados recientemente por Liu y cols. [125], quienes realizaron el tratamiento en una línea celular germinal (C18-4) con diferentes agentes con propiedades alquilantes. El tratamiento con dichos agentes (cisplatino y la ciclofosfamida), no sólo afectó a los telómeros sino que también ocasionó daño en regiones no teloméricas e indujo inhibición de la actividad de la enzima telomerasa, debido a una expresión reducida de terc y tert. Este fenómeno se vio acompañado por un acortamiento a nivel telomérico que se registró a largo plazo, a partir de la sexta generación de ratones (G6) knockout para el gen terc [125].

Por otro lado, nuestros datos indican que si bien la EZ indujo daño en el ADN cromosómico, no hubo una muerte celular retardada en las células ADIPO-P2 inducida por el antibiótico, por lo menos hasta los 15 días postratamiento, ya que no se observó ningún efecto significativo de la EZ sobre la viabilidad celular y tampoco hubo una alteración significativa del IM (Figuras 10 y 11 C).

En resumen, el tratamiento u exposición a otros agentes químicos con propiedades alquilantes, como la MNU [137], el cisplatino, la ciclofosfamida [119],

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generan la pérdida de repetidos teloméricos a largo plazo en mamíferos como consecuencia de la inhibición de la actividad de la enzima telomerasa. En el caso de la EZ solo existe acortamiento telomérico a largo plazo pero nuestros estudios no mostraron correlación con la actividad de la enzima telomerasa.