Motorola Test Mode Select (MTMOD)

La cuantificación de los niveles de melatonina en suero de oveja se llevó a cabo por la técnica de radioinmunoensayo, tratándose de un método sensible y específico para determinar reacciones Ag – Ac.

Fundamento

En dicha técnica, un antígeno marcado radiactivamente se utiliza directa o indirectamente para la medición cuantitativa del antígeno no marcado, estableciendo una fijación de Ac específico u otro sistema receptor. En dicho ensayo, una cantidad conocida de anticuerpo específico reacciona con el correspondiente antígeno unido al radioisótopo (Ag*). El sistema descrito puede esquematizarse como una reacción reversible combinada:

Ag* Ac + Ag* Ac +

Ag Ac + Ag

Donde

Ac representa el anticuerpo específico, Ag* es el antígeno marcado,

Ag es el antígeno libre no marcado de las soluciones patrones o de las muestras desconocidas,

Ac – Ag* es el complejo soluble entre el anticuerpo y el antígeno marcado, y Ac – Ag es el complejo soluble con el antígeno no marcado.

Sobre una cantidad creciente de antígeno, se produce un descenso en la fracción de Ag* unido al anticuerpo. Tras la precipitación de las uniones, este precipitado es cuantificado mediante un contador gamma. La cuantificación de las muestras problema resulta de comparar su actividad con una curva de referencia preparada con estándares conocidos.

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Preparación de las muestras

Para esta determinación, se utilizaron las muestras de suero obtenidas de los vacutainers que no contenían el anticoagulante y que se mantuvieron congeladas a -80 ºC hasta el momento de su análisis.

Reactivos y soluciones

- Kit comercial de radioinmunoensayo (IBL, Hamburg, Germany) • melatonina marcada con 125

I (140 KBq). • Tampón

• Enzima

• Tampón enzimático • Estándar de melatonina

• Antisuero anti-melatonina de conejo • Agentes precipitantes

• Controles (muestras de suero liofilizadas).

Procedimiento

En el suero de las muestras de los animales, se procedió a la determinación de los niveles de melatonina mediante un Kit comercial de RIA (IBL, Hamburg, Germany) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En primer lugar se llevó a cabo el pretratamiento enzimático de los estándares de suero, de las muestra propiamente dichas y de los controles, mediante la adición de una solución enzimática y posterior incubación durante 2 horas a 37ºC en un baño. A continuación se añadió el tampón, la melatonina marcada con 125I y el antisuero y se volvió a incubar durante 40-48 horas. Posteriormente, se añadió el agente precipitante y, tras la última incubación de las muestras durante 15 minutos, se llevó a cabo una centrifugación de 15 minutos a 3000 x g. El último paso es la lectura de las muestras en un lector gamma. Las muestras se realizaron por duplicado y los resultados se expresaron como la media (pg/ml) ± E.E.M. de los niveles de melatonina en suero.

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III.2.2.3.-Análisis de los marcadores de superficie (CD4, CD8, IgM, IgG, IgA y CD21) mediante citometría de flujo.

Los diferentes marcadores de superficie fueron analizados mediante la técnica de citometría de flujo. Esta técnica permite la medición simultánea de múltiples características de partículas en un flujo líquido. En dicha técnica las células y/o partículas están aisladas y en suspensión en un medio líquido y se utilizan anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos para la marcación de proteínas específicas de cada célula, permitiendo el análisis de diferentes poblaciones celulares. Esta técnica tiene aplicación tanto cualitativa (presencia o no de un determinado tipo celular) como cuantitativa. Actualmente son los estudios cuantitativos los que más interés suscitan.

Fundamento

La suspensión celular se hace circular en forma de gotas microscópicas. Las células pasan por un campo de detección atravesado por un potente rayo láser que produce la dispersión de la luz y la activación de la fluorescencia. Mediante sensores específicos se analizan y cuantifican las poblaciones en estudio en función de sus propiedades fisicoquímicas y del marcaje efectuado. Además de basarse en la detección de la fluorescencia emitida por las células marcadas, también lo hace en otras propiedades diferenciales de las células en estudio como tamaño (FSC), complejidad (SSC), etc. (Fig. 18).

R5

R6 R7

Figura 18.- Imagen en dos dimensiones de citometría de flujo (Dot plot). En un eje se representa el tamaño celular (FSC) y en el otro la complejidad celular (SSC).

Linfocitos

Monocitos Granulocitos

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Preparación de las muestras

Las muestras de sangre de las ovejas obtenidas mediante punción venosa se recogieron en vacutainers con EDTA para evitar su coagulación. Estas muestras de sangre fueron diluidas con PBS (1:1) a su llegada al laboratorio. Posteriormente, las PBMCs se aislaron usando gradientes de densidad, empleando para ello Histopaque®- 1.077 (Sigma) a temperatura ambiente. Las muestras así tratadas fueron centrifugadas a 1900 x g durante 20 minutos.

Tras esta primera centrifugación, se obtuvieron cuatro fases en los tubos: en la parte superior permaneció el plasma sanguíneo, a continuación apareció una interfase con las células mononucleares y en la parte inferior se depositaron los eritrocitos y los granulocitos así como los restos celulares (Fig. 19). Las células de la interfase fueron cuidadosamente extraídas y depositadas en otro tubo para su lavado con PBS, mediante la centrifugación de las mismas a 500 x g durante 5 minutos. Tras esta segunda centrifugación se procedió al recuento de las células, mediante una cámara de Neubauer. Antes de llevar a cabo el recuento celular, se analizó la viabilidad celular mediante la tinción de las células con el colorante azul tripán permitiendo de este modo distinguir entre las células vivas (tienen la membrana plasmática intacta y por tanto no penetra el colorante) y las muertas (el colorante penetra en el interior celular debido a que en este caso la membrana plasmática está dañada).

A continuación, las células fueron repartidas en diferentes tubos (5 x 105 células por tubo aproximadamente) para ser incubadas con el correspondiente anticuerpo monoclonal específico marcado, excepto en el caso de la IgA, que fue policlonal. Dicha incubación tuvo lugar a 4ºC durante 30 minutos. Los anticuerpos frente a CD4 y CD21 estaban conjugados con el fluorocromo ficoeritrina (PE), mientras que los anticuerpos CD8, IgM e IgA estaban conjugados con el fluorocromo isotiocianato de fluoresceína (FITC), por tanto, la detección de la fluorescencia en este caso fue directa. Por otro lado, para la determinación de la IgG en superficie se utilizó un método indirecto. En primer lugar las células fueron incubadas con el anticuerpo específico conjugado con biotina durante 30 minutos a 4ºC. Tras el lavado de las células, éstas fueron incubadas (30 minutos a 4ºC) con estreptavidina conjugada con FITC.

El último paso, en ambos casos, consistió en el lavado de las células con el objeto de eliminar el anticuerpo que no se había unido a las células.

84 20 min. 1900 x g SIN FRENO 2) : Histopaque® : Tª ambiente

1) Diluir sangre con PBS

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