• Tampón químico. Su elección afecta la movilidad electroforética de los contra-iones y, por lo tanto, la resolución del gel. Debe ser
no reactivo y no modificar o reaccionar con las proteínas. Se usan varios tampones para cátodo y ánodo (el mismo o distintos) según la aplicación. Los más comunes incluyen Tris, Bis-Tris o imidazol.
• Contraión. Balancea la carga intrínseca del ión del tampón y, a su vez, afecta la fuerza del campo eléctrico durante la
electroforesis. En general, se evitan los iones muy cargados y móviles en el tampón del cátodo en PAGE/SDS pero pueden ser incluidos en la trama del gel donde migran por delante de las proteínas. Contraiones muy populares son la glicina y la tricina. La glicina se usa como fuente de ión“trailing” (que va dejando cola; es decir rápido y que arrastra a las proteínas tras de sí) o lento porque su pKa es 9,69 y la movilidad del glicinato se puede fijar en un valor menor al de las proteínas más lentas conocidas (pH 6,8 del gel de concentración). El pH mínimo de este rango es aproximadamente 8.
• Acrilamida (C3H5NO; PM: 71,08). Cuando se disuelve en agua se auto-polimeriza espontanea pero muy lentamente. Los
monómeros se unen en forma cabeza-cola en largas cadenas lineales que no se entrecruzan. La presencia de sistemas generadores de radicales libres acelera la polimerización. La solución se vuelve viscosa pero no forma un gel a menos que se entrecrucen estas cadenas. Se recomienda guardar la solución acuosa en un lugar fresco, oscuro y seco para evitar la auto- polimerización u hidrólisis. Acrilamida es una neurotoxina.
• Bisacrilamida (N,N′-Methylenebisacrylamide) (C7H10N2O2; PM: 154,17). Es el crosslinker más frecuentemente usado para PAGE.
Químicamente puede imaginarse como dos moléculas de acrilamida unidas cabeza-cabeza por sus extremos no reactivos, y entonces puede entrecruzar dos cadenas de poliacrialmida lineales generando un gel.
• Dodecil sulfato de sodio (SDS) (C12H25NaO4S; PM: 288,38). (Sólo en geles PAGE desnaturalizantes) Es un detergente fuerte
usado para desnaturalizar proteínas nativas y generar polipéptidos individuales desplegados. Cuando una mezcla de proteínas es calentada a 100°C en presencia de SDS, éste envuelve el esqueleto polipeptídico. Se une a los polipéptidos en una proporción constante de 1,4 g SDS/ g de proteína. En este proceso, las cargas intrínsecas se vuelven despreciables. Entonces, después del tratamiento los polipéptidos adquieren estructura de cigarro con una densidad de carga uniforme. Las movilidades electroforéticas de estas proteínas es una función lineal de los logaritmos de su peso molecular. Sin SDS (geles nativos) proteínas con PM similar migrarán diferentemente debido a diferencias en la relación carga-masa y en la conformación tridimensional que poseen.
• Persulfato de amonio (APS) (N2H8S2O8; PM: 228,2). APS es una fuente de radicales libres y se usa como iniciador de la formación
del gel.
• TEMED (N, N, N′, N′-tetrametiletilendiamina) (C6H16N2; PM: 116,21). TEMED estabiliza los radicales libres y mejora la
polimerización. La velocidad de polimerización y las propiedades del gel resultante dependen de las concentraciones de radicales libres; un exceso da un largo promedio de polímero más corto, incremento en la turbidez y menor elasticidad, mientras que su defecto provoca el efecto inverso. Las menores concentraciones que permitan la polimerización en un tiempo razonable (15-40 min) se deben usar. El APS y el TEMED se usan típicamente en concentraciones equimoleculares (1-10 mM).
Electroforesis de proteínas (componentes)
• Colorante de trazado. Durante la corrida las proteínas son incoloras y es difícil seguir el grado
de avance. Entonces, se agrega un colorante aniónico (al tampón de siembra de la muestra) de movilidad electroforética conocida. El azul de bromofenol es el más usado (3',3”,5',5”
tetrabromofenolsulfoftaleína), es coloreado a pH neutro y levemente alcalino, cargado
negativamente se mueve hacia el ánodo más rápidamente que la mayoría de las proteínas. Cuando llega al extremo del gel la corrida se detiene. Puede pegarse débilmente a algunas proteínas dándoles un leve color azul.
• Asistencia en la siembra. La mayoría de los sistemas de PAGE se cargan en pocillos en la
parte superior del gel. Para asegurar que la muestra se hunda en el fondo del pocillo y no flote se suplementa con aditivos que aumentan la densidad de la misma. Deben ser no-iónicos y no-
reactivos (glicerol y sacarosa).
• Coomassie Brilliant Blue R-250 (C45H44N3NaO7S2; PM: 825,97). Es el más popular para el
teñido de estos geles. Es aniónico se une inespecífica e irreversiblemente a las proteínas. Es no polar, se usa en solución alcohólica (etanol, metanol, isopropanol) acidificada con ácido acético (que además fija las proteínas en el gel). El gel se tiñe completamente y se destine con la misma solución pero sin colorante. Las proteínas se visualizan como bandas azules sobre un fondo transparente.
• Tinción con plata. Es mucho más sensible (unas 50 veces) que el Coomassie (50 ng
proteína por banda). Se desconoce el mecanismo de tinción. Las proteínas se tiñen de acuerdo a sus propias características en colores desde el amarillo al marrón oscuro. Se recomienda el uso de recipientes muy limpios, reactivos muy puros y guantes para asegurar el éxito de la técnica.
_______________________EjemploI______________________
✓ Hepatocitos primarios que luego serán injertados en parénquima de
hígados receptores (se los marca con un compuesto fluorescente verde para distinguirlo de los hepatocitos endógenos).
✓ Transfección transiente. PEI (polietilenimina, es un policatión); Jet-PEI
(Qbiogen GDSP10110).
HO-(CH2)2-(CH2-CH2-NH)n-(CH2)2-OH
✓ Plásmidos: pCH110 (β-gal, se usa como control) y pKM4 (deriv.
pcDNA3, expresa FNR). Purificados con kit PureFection®: A260/A280=
1,79 y 1,72. 450 µg y 750 µg totales.
✓ Detección: Actividad β-galactodidasa (X-gal, tinción azul) e
Immunodetección transgén (FNR, tinción roja).
Transfección
✓ Células quiescentes a confluencia (para líneas continuas se usa 50-
60% confluencia en placa). Sembradas 18h antes.
✓ N/P (relación nitrógenos del PEI a fosfatos del ADN) se usó 5 para
JetPEI (según instructivo) y de 9 para PEI (según literatura). Volúmen de complejo PEI/plásmido < 1/10 medio de cultivo.
✓ 0,5-2 μg/ 106 células. 4 h (con o sin SFB). Luego agregar medio (las
células sufren). (10 μg ADN/ 106 células para líneas)
________________Ejemplo I_________________
0,155 ± 0,23 %
0,09 ± 0,15 %
________________Ejemplo I_________________
Control
FNR
detección rojizaFluorescencia verde
células injertadas
Transfectados