Chapter 2: Evaluating EU performance in multilateral negotiations: An
2.3 The negotiation position
Como último paso para realizar la selección del soporte adecuado para la inmovilización de la enzima MnP, y teniendo en cuenta la aplicación concreta para la que se pretende destinar la enzima inmovilizada, se consideró el estudio de la adsorción del tinte Orange II a cada uno de los soportes. Para ello se analizó el porcentaje de retención de Orange II en dichos soportes tras 4 h de puesta en contacto con una disolución de 400 mg/L de tinte (Figura 5.9).
0 20 40 60 80 100 120
i ii iii iv v vi vii viii
Soporte P o rc ent a je ads orci ón (% )
Figura 5.9. Adsorción de 400 mg/L de Orange II tras 4 h: (i) Sepabeads-EC3; (ii)
Sepabeads-EA; (iii) Agarosa-detrano-aspártico; (iv) Sepabeads-PEI; (v) Agarosa- glutaraldehido; (vi) Sepabeads-EP; (vii) Sepabeads-EP (long arm); (viii) Agarosa-amino
Se analizó la adsorción que producen los soportes comerciales Sepabeads- EC3 y Sepabeads-EA: el primero es la base que se activa para la obtención de los demás soportes Sepabeads y está formado por grupos epóxido en su superficie; el segundo está constituido por grupos amino. Sepabeads-EC3 apenas adsorbió Orange II, mientras que Sepabeads-EA alcanzó una adsorción próxima al 100%. El resto de los soportes estudiados adsorbieron cerca del 100% de los 400 mg/L de tinte con los que se pusieron en contacto, con la excepción de Sepabeads-EP. Se deduce que los soportes que contienen grupos amino, que son la mayoría de los soportes estudiados, adsorben el tinte Orange II en gran extensión. La adsorción probablemente se produce entre los grupos amino y los grupos sulfónicos de las moléculas de Orange II.
4. Conclusiones
La selección de un soporte para la inmovilización enzimática es un proceso basado tradicionalmente en ensayo y error. Se realizaron ensayos con una gran variedad de soportes de distintas naturalezas, activados a partir de dos soportes base: agarosa, un gel polimérico con grupos alcohólicos en su superficie; y Sepabeads, una resina epoxiacrílica con buenas propiedades mecánicas. Se analizaron una serie de factores a partir de los derivados obtenidos, y los
resultados se consideraron para la selección del derivado más adecuado para su aplicación en la degradación enzimática de Orange II.
En primer lugar, se analizó la capacidad de retención de la enzima y, de forma paralela, la pérdida de actividad enzimática durante el proceso de inmovilización. Los derivados basados en interacciones iónicas presentaron una alta retención enzimática, excepto el soporte Sepabeads-IDA, y mantuvieron la actividad durante el proceso. Dentro de estos, los soportes policatiónicos ofrecieron enlaces más fuertes. Por el contrario, el derivado de agarosa-dextrano- aspártico presentó una muy fácil desorción; sin embargo, la fuerza iónica necesaria para producir la desorción y la reversibilidad de los enlaces es muy superior a la fuerza iónica presente en el medio de degradación de Orange II, como indicaron los valores de conductividades para ambas disoluciones. Esto permite considerar este derivado como una alternativa para la inmovilización de MnP. Entre los derivados basados en enlaces covalentes, sólo el de agarosa- glutaraldehido y agarosa-amino consiguieron una retención total, pero las condiciones de inmovilización fueron severas y afectaron a la estabilidad enzimática en proporciones del 50 y 60% respectivamente. El derivado de agarosa-amino implicó la oxidación de los grupos alcohólicos presentes en los azúcares situados alrededor de las enzimas y el posterior bloqueo de los grupos que no reaccionaron con el soporte. Dado que el grado de glicosilación de la enzima es un factor depediente en gran medida de las condiciones de cada fermentación, el derivado obtenido de esta forma puede variar considerablemente; teniendo en cuenta esto y el hecho de que la pérdida de actividad durante el bloqueo de los grupos fue considerable, se desestimó este derivado como posible opción a la inmovilización de la enzima.
Como segundo factor se analizó la estabilidad de los derivados frente a la temperatura. Los soportes policatiónicos dieron lugar a derivados de muy baja estabilidad. Por el contrario, el derivado aniónico de agarosa-dextrano-aspártico presentó una estabilidad superior a la de la enzima soluble, y el de agarosa- glutaraldehido mantuvo también una estabilidad aceptable, con lo cual se consideraron estos dos últimos soportes como candidatos para la inmovilización de MnP.
Para llevar a cabo el proceso de decoloración de Orange II mediante enzima MnP inmovilizada, se pretende que la interacción entre el tinte y el soporte sea nula, para evitar fenómenos de adsorción que enmascaren el propio proceso de
degradación del tinte. Se consideró como tercer factor la interacción entre ambos, pero no fue factor determinante, pues los dos soportes fueron capaces de adsorber casi el 100% de la concentración de tinte considerada, que fue 4 veces superior a la empleada en los ensayos de decoloración.
Como factores adicionales se deben tener en cuenta el coste del soporte y la facilidad del proceso de activación y posterior inmovilización de la enzima. Ambos soportes fueron activados a partir de agarosa, con lo cual el coste no fue un factor determinante. Sin embargo, sí hubo una considerable diferencia en la dificultad de activación. El proceso de activación del soporte de agarosa- dextrano-aspártico es laborioso y de aproximadamente 15 d de duración, mientras que los soportes de agarosa-glutarladehido se pueden activar en 3 d. Teniendo en cuenta la posibilidad de aplicación del proceso de decoloración a escala industrial, son necesarias grandes cantidades de enzima inmovilizada fresca para reponer la enzima consumida durante el proceso, con lo cual la sencillez de activación del soporte se convierte en una prioridad. Debido a esto, se consideró el soporte de agarosa-glutaraldehido como el más adecuado para la inmovilización de MnP y posterior aplicación en la decoloración en continuo de Orange II.
El soporte agarosa-glutaraldehido interacciona covalentemente con la enzima, de manera que da lugar a enlaces multipuntuales fuertes tipo base de Schiff entre los grupos aldehido del soporte y los grupos amino de la enzima. Esto aporta la ventaja de que la retención es fuerte y la enzima no se desorbe del soporte; como contrapartida, el proceso no es reversible y el soporte no es recuperable.
5. Referencias
Abadulla, E., Tzanov, T., Costa, S., Robra, K. H., Cavaco-Paulo, A. and Gübitz, G. M. (2000) Decolorization and detoxification of textile dyes with a laccase from Trametes
hirsuta. Applied and Environmental Microbiology 66(8), 3357-3362.
Bar-Eli, A. and Katchalski, E. (1960) A water-insoluble trypsin derivative and its use as a trypsin column. Nature 188, 856-857.
Blandino, A., Macías, M. and Cantero, D. (2000) Glucose oxidase release from calcium alginate gel capsules. Enzyme and Microbial Technology 27, 319-324.
Bornscheuer, U. T. (2003) Immobilizing enzymes: how to create more suitable biocatalysts. Angewandte Chemie, International Edition 42(29), 3336-3337.
Durán, N., Rosa, M. A., D'Annibale, A. and Gianfreda, L. (2002) Applications of laccases and tyrosinases (phenoloxidases) immobilized on different supports: a review. Enzyme
and Microbial Technology 6179, 1-25.
Gianfreda, L. and Scarfi, M. R. (1991) Enzyme stabilization: state of the art. Molecular
and Cellular Biochemistry 109, 97-128.
Godjevargova, T., Dayal, R. and Turmanova, S. (2004) Gluconic acid production in bioreactor with immobilized glucose oxidase plus catalase on polymer membrane adjacent to anion-exchange membrane. Macromolecular Bioscience 4, 950-956.
Grabski, A. C., Coleman, P. L., Drtina, G. J. and Burgess, R. R. (1995) Immobilization of manganese peroxidase from Lentinula edodes on azlactone-functional polymers and generation of Mn3+ by the enzyme-polymer complex. Applied Biochemistry and
Biotechnology 55, 55-73.
Guisán, J. M., Bastida, A., Blanco, R. M., Fernández-Lafuente, R. and García-Junceda, E. (1997) Immobilization of enzymes acting on macromolecular substrates. Reduction of steric problems. In: Methods in Biotechnology. Immobilization of Enzymes and Cells. Bickerstaff, G. F. Totowa (N.J.), Humana Press Inc. 1: 261-275.
Illanes, A., Wilson, L. and Tomasello, G. (2000) Temperature optimization for reactor operation with chitin-immobilized lactase under modulated inactivation. Enzyme and
Microbial Technology 27, 270-278.
Katchalski-Katzir, E. and Kraemer, D. M. (2000) EupergitR C, a carrier for
immobilization of enzymes of industrial potential. Journal of Molecular Catalysis B:
Enzymatic 10, 157-176.
Krajewska, B. (2004) Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme immobilizations: a review. Enzyme and Microbial Technology 35, 126-139.
Li, B. and Takahashi, H. (2000) New immobilization method for enzyme stabilization involving a mesoporous material and an organic/inorganic hybrid gel. Biotechnology
Letters 22, 1953-1958.
Mateo, C., Abián, O., Fernández-Lafuente, R. and Guisán, J. M. (2000a) Increase in conformational stability of enzymes immobilized on epoxy-activated supports by favoring additional multipoint covalent attachment. Enzyme and Microbial Technology 26, 509- 515.
Mateo, C., Abián, O., Fernández-Lafuente, R. and Guisán, J. M. (2000b) Reversible enzyme immobilization via a very strong and nondistorting ionic adsorption on support- polyethylenimine composites. Biotechnology and Bioengineering 68(1), 98-105.
Mateo, C., Fernández-Lorente, G., Abián, O., Fernández-Lafuente, R. and Guisán, J. M. (2000c) Multifunctional epxoy supports: a new tool to improve the covalent immobilization of proteins. The promotion of physical adsorptions of proteins on the supports before their covalent linkage. Biomacromolecules 1, 739-745.
Mielgo, I., Palma, C., Guisán, J. M., Fernández-Lafuente, R., Moreira, M. T., Feijoo, G. and Lema, J. M. (2003) Covalent immobilisation of manganese peroxidases (MnP) from
Phanerochaete chrysosporium and Bjerkandera sp. BOS55. Enzyme and Microbial Technology 32, 769-775.
Norouzian, D., Hosseinzadeh, A., Inanlou, D. N. and Moazami, N. (1999) Various techniques used to immobilize naringinase produced by Penicillium decombens PTCC 5248. World Journal of Microbiology & Biotechnology 15, 501-502.
Oh, J. T. and Kim, J. H. (2000) Preparation and properties of immobilized amyloglucosidase on non-porous PS/PNaSS microspheres. Enzyme and Microbial
Technology 27, 356-361.
Olea, D. and Faure, C. (2003) Quantitative study of the encapsulation of glucose oxidase into multilamellar vesicles and its effect on enzyme activity. Journal of Chemical Physics
119(12), 6111-6118.
Palmieri, G., Giardina, P., Desiderio, B., Marzullo, L., Giamberini, M. and Sannia, G. (1994) A new enzyme immobilization procedure using copper alginate gel: application to a fungal phenol oxidase. Enzyme and Microbial Technology 16, 151-158.
Peralta-Zamora, P., Gomes de Moraes, S., Esposito, E., Antunes, R., Reyes, J. and Durán, N. (1998) Decolorization of pulp mill effluents with immobilized lignin and manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium. Environmental Technology 19, 521-528. Reischwitz, A., Reh, K. D. and Buchholz, K. (1995) Unconventional immobilization of dextransucrase with alginate. Enzyme and Microbial Technology 17, 457-461.
Sasaki, T., Kajino, T., Li, B., Sugiyama, H. and Takahashi, H. (2001) New pulp biobleaching system involving manganese peroxidase immobilized in a silica support with controlled pore sizes. Applied and Environmental Microbiology 67(5), 2208-2212.
Tanriseven, A., Uludag, Y. B. and Dogan, S. (2002) A novel method for the immobilization of glucoamylase to produce glucose from maltodextrin. Enzyme and
Microbial Technology 30, 406-409.
van Aken, B., Ledent, P., Naveau, H. and Agathos, S. N. (2000) Co-immobilization of manganese peroxidase from Phlebia radiata and glucose oxidase from Aspergillus niger on porous silica beads. Biotechnology Letters 22, 641-646.
van de Velde, F., Lourenco, N. D., Pinheiro, H. M. and Bakker, M. (2002) Carrageenan: a food-grade and biocompatible support for immobilisation techniques. Advances Synthesis
& Catalysis 344(8), 815-835.
Vodopivec, M., Berovic, M., Jancar, J., Podgornik, A. and Strancar, A. (2000) Application of convective interaction media disks with immobilised glucose oxidase for on-line glucose measurements. Analytica Chimica Acta 407, 105-110.
Wheatley, J. B. and Schmidt Jr., D. E. (1999) Salt-induced immobilization of affinity ligands onto epoxide-activated supports. Journal of Chromatography A 849, 1-12.