Net efficiency

Se concluye que a partir de protocolos de extracción y amplificación en muestras de tejido de órganos como hígado, riñón y músculo de dos especímenes colectados, se logra obtener la secuencia de un fragmento que consta en 364 pares de bases del gen 16s de ADN mitocondrial, lo que representa la primera caracterización molecular para la especie Atractus crassicaudatus.

El alineamiento múltiple entre las secuencias del género Atractus obtenidas del GenBank, en relación con la secuencia descrita para Atractus crassicaudatus permite evidenciar similaridades entre las regiones de ADN del gen 16s, esto gracias a la ubicación de tres regiones conservadas a lo largo de las secuencias, lo que soporta la cercanía evolutiva entre las especies de dicho género y una correcta clasificación taxonómica.

La construcción del árbol filogenético obtenido mediante el modelo evolutivo General Reversible en el Tiempo (GTR) y el criterio estadístico de Máxima Verosimilitud (ML) evidencia la cercanía evolutiva de Atractus crassicaudatus, en comparación con los géneros con descripción molecular del gen 16s, con la representación de un cladograma, en el cual los valores de verosimilitud del nodo se encuentran entre el 0,63 y el 0,92, lo que permite inferir una cercanía evolutiva aceptable entre las especies utilizadas para la investigación.

La especie Atractus crassicaudatus conforma un clado monofilético junto con A. cerberus, A. gigas, A. typhon, A. pironi, A. savagei, A. paucidens y A. modestus con un porcentaje de

cobertura del nodo de 0,90, la monofilia de dicho clado es similar a la reportada por investigaciones anteriores.

La organización de las especies dentro del árbol filogenético obtenido permiten evidenciar la diversificación del género Atractus, donde la especie problémica Atractus crassicaudatus se encuentra más próxima a especies descritas hacia el sur de la Cordillera de los Andes, lo que permite plantear la hipótesis de posibles diversificaciones dadas por el surgimiento de la cadena montañosa, sin embargo la verdadera construcción evolutiva presenta incertidumbres al no poseerse la totalidad de descripciones moleculares de las 140 especies que contiene el género.

7. RECOMENDACIONES

Se recomienda ampliar el uso de marcadores moleculares tales como Cytb, ND4, CMOS, RAG1 y NT3, los cuales podrán permitir la obtención de un árbol filogenético con soportes de confiabilidad más óptimos.

Para Obtener una mayor confiabilidad en la filogenia del género es recomendable realizar descripciones moleculares de un mayor número de especies, puesto que la amplitud del grupo (140 especies) no se ha descrito molecularmente en su totalidad, es necesario mencionar la carencia de datos en especies colombianas lo que plantea la necesidad de centrar investigaciones de este tipo para el país.

Es necesario evaluar genéticamente los distintos morfotipos de la especie Atractus crassicaudatus, ya que pueden presentar diferencias en cuanto a secuencias de marcadores moleculares, lo que permitiría inferir la plasticidad de la especié o posibles procesos de especiación.

8. ANEXOS

ANEXO1. El procedimiento para realizar electroforesis se describe a continuación: 1. 0,45g de agarosa

2. En un Erlenmeyer adicionar 30ml de TBE a una concentración de 1X, posteriormente llevarlo en una plancha de calentamiento.

3. Cuando el TBE esté en su punto de ebullición, se debe adicionar 0,45g de agarosa (agitar con la ayuda de una barra magnética)

4. Retirar el Erlenmeyer con la solución y en 3 min adicionar 2 μLde gel RED 5. Servir la mezcla en la cámara con el peine de pozos previamente fijado 6. Dejar polimerizar el gel por 20 min (aprox.)

Nota: Es importante cubrir la cámara, ya que la exposición a luz puede afectar directamente el rendimiento y funcionalidad del gele, por lo que se recomienda realizar el montaje con mínimas condiciones de luz.

7. Retirar cuidadosamente el peine de la cámara con el gel

8. Ubicar la cámara a la cámara de electroforesis, teniendo en cuenta la ubicación de los polos eléctricos de la misma

9. Servir las muestras por pozo, en donde:

● 2 ul de 5x DNA Loading buffer blue (BIOLINE) ● 2 ul de Marcador Hyperlade

Anexo 3.Alineaciones de las secuencias del género Atractus y un Outgroup (Sibon

nebulata), la alineación se realiza con el software ClustalX, las columnas con * representan las zonas más conservadas de las secuencias, en las otras zonas se observan gaps e indels.

Anexo 4. En las siguientes dos tablas se observan las secuencias obtenidas a partir de las muestras de tejido tomadas de los especímenes del género Atractus (H:Hígado, M:Músculo, R:Riñón) Especimen A H cctgttttacaaaaacataacctttagccaaacaaatattaaaggcaacgcctgcccagtgaccaattaaacggccgcg gtaccctaaccgtgcaaaggtagcgtaatcatttgtctattaattgtagaccagtatgaaaggcacaatgagggtccacc tgtctcttatagtaaatcgataaactgatcttctagtaaaaaagctaaaatacacacacaagaccagaagaccctgtgaa gcttaaactaaactattaaaccctataatacctactttcggttggggcgaccttggaaaaaaaaagaacttccaaatatat gaccataactcacacaccggcctacaagcctacacagac Ma cctgttttacaaaaacataacctttagccaaacaaatattaaaggcaacgcctgcccagtgaccaattaaacggccgcg gtaccctaaccgtgcaaaggtagcgtaatcatttgtctattaattgtagaccagtatgaaaggcacaatgagggtccacc tgtctcttatagtaaatcgataaactgatcttctagtaaaaaagctaaaatacacacacaagaccagaagaccctgtgaa gcttaaactaaactattaaaccctataattatacctactttcggttggggcgaccttggaaaaaagaacttccaaatatat gaccataactcacacaccggcctacaagcctacacagac Mb cctgttttacaaaaacataacctttagccaaacaaatattaaaggcaacgcctgcccagtgaccaattaaacggccgcg gtaccctaaccgtgcaaaggtagcgtaatcatttgtctattaattgtagaccagtatgaaaggcacaatgagggtccacc tgtctcttatagtaaatcgataaactgatcttctagtaaaaaagctaaaatacacacacaagaccagaagaccctgtgaa gcttaaactaaactattaaaccctataataaatactttcggttggggcgaccttggaaaaaaaaagaacttccaaatata tgaccataactcacacaccggcctacaagcctacacagac R cctgttttaaaaaaaacataacctttagccaaacaaatattaaaggcaacgcctgcccagtgaccaattaaacggccgc ggtaccctaaccgtgcaaaggtagcgtaatcatttgtctattaattgtagaccagtatgaaaggcacaatgagggtccac ctgtctcttatagtaaatcgataaactgatcttctagtaaaaaagctaaaatacacacacaagaccagaagaccctgtga agcttaaactaaactattaaaccctataatacctactttcggttggggcgaccttggaaaaaaaaagaacttccaaatat atgaccataactcacacaccggcctacaagcctacacagac Especimen B H cctgttttacaaaaacataacctttagccaaacaaatattaaaggcaacgcctgcccagtgaccaattaaacggccgcg

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Anexo5. A continuación se realiza la descripción de características generales de cada especie consultada en la investigación. Se consigna Autor y fecha de descripción

● Atractus roulei (Despax, 1910): Esta especie se caracteriza por una coloración dorsal uniformemente marrón, muy similar a Atractus Carrioni distinguible en el número de escamas ventrales, su distribución está determinada para el suroeste del Ecuador y la Cordillera de Huancabamba en Perú (Passos et al. 2013). La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.

● Atractus pyroni (Arteaga, Mebert, Valencia, Cisneros-Heredia, Peñafiel, Reyes- Puig, Vieira-Fernandes & Guayasamin, 2017): Para la descripción de esta especie se notifica un tono marrón dorsal con escamas paravertebrales de color dorado, su distribución se encuentra en la Provincia De Bolívar, Ecuador (Arteaga et al. 2017). La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.

● Atractus paucidens (Despax, 1910): Esta especie se caracteriza por tener coloración negro en la parte dorsal con bandas de color crema a los costados, su distribución está determinada para la Provincia de Pichincha, Ecuador (Passos et al. 2009). La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.

● Atractus occidentalis (Savage, 1955): Esta especie se diferencia de sus congéneres ecuatorianos por coloraciones en forma de rayas longitudinales rotas o incompletas. Su distribución está determinada para la Provincia de Pichincha, Ecuador (Wallach et al. 2014). La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.

● Atractus multicinctus (Jan 1865): Se caracteriza por poseer un color beige del fondo del dorso con franjas negras anchas que se alternan en los lados, su distribución está determinada para el departamento del Valle del Cauca, Colombia (Castro y Vargas, 2008). La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.

● Atractus modestus (Boulenger, 1894): Como caracter diagnostico de esta especie se puede distinguir un dorso color marrón oscuro con un collar claro nucal y bandas paraventrales en especímenes juveniles, su distribución está determinada para el occidente de ecuador y el Perú (Passos et al. 2007). La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.

● Atractus microrhynchus (Cope, 1868): Esta especie se puede distinguir por su coloración dorsal marrón acompañada de una banda occipital incompleta, su distribución está determinada para la región del Tumbes en la frontera entre Ecuador y Perú (Passos et al. 2012). La descripción del gen 16s de la especie se

encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.

● Atractus major (Boulenger 1894): Esta especie presenta un patrón de coloración que consiste en manchas de color marrón oscuro con bordes amarillos en su parte dorsal, la distribución de esta especie se determina para una amplia zona que comprende a Venezuela, Colombia, ecuador, Perú y Brasil (Esqueda et al. 2005). La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.

● Atractus iridescens (Peracca, 1896): esta especie es visiblemente caracterizada por una coloración pardo rojizo disperso con manchas oscuras pequeñas e irregulares en su parte dorsal, la distribución de esta especie está determinada para Colombia y Ecuador (Passos et al. 2009). La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.

● Atractus esepe (Arteaga, Mebert, Valencia, Cisneros-Heredia, Peñafiel, Reyes- Puig, Vieira-Fernandes & Guayasamin, 2017): Esta especie, muy cercana al grupo de A. Iridescens se caracteriza por una coloración dorsal de fondo marrón con un patrón de líneas oscuras completas, su distribución está determinada para la Provincia De Esmeraldas en Ecuador (Arteaga et al. 2017). La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.

● Atractus elaps (Günter, 1858) : Esta especie se caracteriza por una visibilidad de colores en su parte dorsal que comprenden unos anillos rojos con negro, la distribución de esta especie está descrita para Colombia, Ecuador, Perú, Brasil, Venezuela y Bolivia (Passos et al. 2013). La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.

● Atractus dunni (Savage, 1955): Esta especie se puede caracterizar por presentar un patrón de cinco franjas oscuras longitudinales y dos series de manchas en la región dorsal, su distribución está determinada para Ecuador (Cisneros, 2015). La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.

● Atractus cerberus (Arteaga, Mebert, Valencia, Cisneros-Heredia, Peñafiel, Reyes- Puig, Vieira-Fernandes & Guayasamin, 2017): Visiblemente esta especie se caracteriza por tener una coloración dorsal marrón con bandas negras tenues, la distribución está determinada para Ecuador (Arteaga et al. 2017). La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas. ● Atractus carrioni (Parker, 1930): Se caracteriza por una coloración uniformemente

gris o marrón, su distribución está determinada para Ecuador (Passos y Arredondo, 2009). La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.

● Atractus schach (Boie, 1827): Esta especie se caracteriza por una coloración dorsal marrón claro con manchas negras rectangulares alternas y una línea vertebral negra (Hoogmoed, 1980) la distribución de esta especie está determinada para la región de Guyana (Wallach et al. 2014). La secuencia del gen 16s de la especie fue descrita por Vidal et al (2000) en su estudio de relaciones filogenéticas de serpientes Dipsadinas.

● Atractus badius (Boie, 1827): Descripciones de esta especie la caracterizan por una cabeza corta y puntiaguda, además de una coloración roja con pares de bandas negras (Hoogmoed, 1980), su distribución está determinada para Colombia, Brasil, Guyana, Perú y Suriname (Wallach et al. 2014). La secuencia del gen 16s de la especie fue descrita por Simões et al. (2016) en un análisis evolutivo de serpientes. ● Atractus flammigerus (Boie, 1827): una característica autopomórfica de esta

especie es que tiene quillas sobresalientes en hileras de escamas dorsales del cuerpo, sobretodo en machos, la distribución de esta especie está determinada para la región de Guyana, Brasil y Perú (Passos et al. 2017). La secuencia del gen 16s de la especie fue descrita por Vidal et al (2000) en su estudio de relaciones filogenéticas de serpientes Dipsadinas.

● Atractus resplendens (Werner, 1901): Para esta especie se describe un color marrón hasta negro en su parte dorsal, la distribución está determinada para el amazonas ecuatoriano (Wallach, 2014). La descripción del gen 16s de la especie fue dada por Pyron et al. (2015) en un estudio sistemático de las relaciones entre la tribu Nothopsini del grupo de Dipsadinos en la costa pacífica entre los territorios de Ecuador y Colombia.

● Atractus gigas (Myers y Schargel, 2006): Está especie presenta variaciones en su coloración que se caracterizan por imitar a una coral, la distribución de esta especie esta determinada para Ecuador y Perú (Passos et al. 2010). La descripción del gen 16s de la especie fue dada por Pyron et al. (2015) en un estudio sistemático de las relaciones entre la tribu Nothopsini del grupo de Dipsadinos en la costa pacífica entre los territorios de Ecuador y Colombia.

● Atractus duboisi (Boulenger, 1880): Esta especie presenta una coloración dorsal negra con puntos paravertebrales amarillentos, su distribución está determinada para Ecuador (Passos et al. 2009). La descripción del gen 16s de la especie fue dada por Pyron et al. (2015) en un estudio sistemático de las relaciones entre la tribu Nothopsini del grupo de Dipsadinos en la costa pacífica entre los territorios de Ecuador y Colombia.

● Atractus lehmani (Boettger, 1898): Se caracteriza por una coloración marrón dorsal y se emparenta morfológicamente con Atractus resplendens, su distribución esta determinada para el Valle del Cauca en Colombia y Ecuador (Passos et al. 2009). La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.

● Atractus zidocki (Gasc y Rodríguez 1979): Se caracteriza por su coloración pardo oscura con pequeñas manchas negras en su cabeza, esta especie se distribuye por la amazonia colombiana, la región del Pará brasileño, la Guyana Francesa y Guyana (Silva, 2004). La secuencia del gen 16s de la especie fue descrita por Vidal et al (2000) en su estudio de relaciones filogenéticas de serpientes Dipsadinas.

● Atractus tartarus (Prudente y Lynch 2016): Se caracteriza por colores dorsales que varían entre el marrón y beige, color ventral blanco, esta especie se distribuye en el estado de Pará en Brasil (Passos et al. 2016). La secuencia del gen 16s fue descrita por De Oliveira y Hernández (2016) en su estudio de variaciones morfológicas de la especie acompañado de una filogenia preliminar del género.

● Atractus trihedrurus (Amaral 1926): Se caracteriza por poseer un dorso uniformemente beige, marrón grisáceo o negro en especímenes adultos y beige o rojo crema con bandas negras en especímenes juveniles, esta especie se distribuye hacia el sur de Brasil en el estado de Santa Catarina y el noroeste de Argentina (Cacciali et al, 2007). La secuencia del gen 16s en la especie fue descrita por Zaher et al. (2009) en su estudio de análisis filogenético de Dipsadinas con énfasis en especies de América del sur.

● Atractus albuquerquei (Da Cunha y Do Nascimento, 1983): Según descripciones de Holotipos esta especie se caracteriza por la coloración dorsal de la cabeza y el cuerpo marrón claro desde la sección rostral hasta el final de la cola y la superficie ventral del cuerpo con tonos cremas uniformemente claros, su distribución está determinada para el estado de Pará al norte de Brasil (Zaher et al. 2005). La secuencia del gen 16s se encuentra descrita por Zaher et al. (2009) en su estudio de análisis filogenético de Dipsadinas con énfasis en especies de América del sur. ● Atractus typhon (Passos, Mueses-Cisneros, Lynch y Fernandes, 2009): Esta

especie se caracteriza por tener un color de fondo dorsal beige, franjas negras alternadas por cuadros de color marrón y su distribución está determinada para el sur occidente de Colombia, específicamente en el departamento de Nariño (Passos

et al., 2009). La descripción del gen 16s de la especie fue dada por Pyron et al. (2015) en un estudio sistemático de las relaciones entre la tribu Nothopsini del grupo de Dipsadinos en la costa pacífica entre los territorios de Ecuador y Colombia.

● Atractus touzeti (Schargel, Lamar, Passos, Valencia, Cisneros-Hereda & Campbell, 2013): Las descripciones para esta especie determinan un patrón de color dorsal de bandas cruzadas pálidas cortas rodeadas por bordes negros, su distribución está descrita para la Cordillera De Los Guacamayos en la Provincia Del Napo, Ecuador (Schargel et al. 2018). La descripción del gen 16s de la especie fue dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.

● Atractus savagei (Salazar-Valenzuela, Torres-Carvajal & Passos, 2014): Esta especie se caracteriza por tener un color dorsal marrón con puntos de color negro en las márgenes de las escamas y dos líneas longitudinales negras a cada lado del cuerpo, su distribución está determinada para la Provincia del Carchi, Ecuador (Salazar et al. 2014). La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.

Anexo5. A continuación se oberva el árbol filogenético obtenido mediante análisis bayesiano. La especie Atractus crassicaudatus mantiene relación con su grupo hermano Atractus cerberus.

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