A New Evaluation Criteria to Cloud Based Access Control models

8.2.1. Identificación por trampa lineal, LTQ

Para chequear la composición proteica de los extractos de las capas íntima y media aisladas por LMD, se emplearon extractos de coronaria preaterosclerótica de necropsia en tampón de lisis urea 7M, tiourea 2M, Tris 30mM, CHAPS 4% y DTT 1%, previamente desalados empleando las microcolumnas Protein Desalting Spin Columns (Pierce), y precipitados con acetona fría. Se resuspendió el precipitado en urea 8M, tras lo cual se redujo con DTT 10mM durante 1 hora a 56ºC. Posteriormente, se alquiló con IAA durante 30 minutos en oscuridad. A continuación se redujo la concentración de urea hasta 2M mediante adición de bicarbonato amónico 100mM pH 8.5, y se llevó a cabo la digestión con tripsina con grado de secuenciación (Roche) a una dilución 1:50 durante una noche a 37ºC. Tras llevar a cabo una concentración de las muestras en un

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SpeedVac (Thermo Fisher) y un desalado de éstas en una columna de fase reversa, los péptidos se analizaron en un espectrómetro de masas tipo trampa lineal LTQ (Thermo Fisher). Se llevaron a cabo dos carreras de LC-MS/MS con cada muestra y los resultados de ambas se combinaron. El desalado de los péptidos así como su separación se llevó a cabo en una columna BioBasic C-18 PicoFrit (75µm de diámetro interno y 10cm de longitud, New Objective) a un flujo de 200 nL/min, empleando agua miliQ y acetonitrilo con 0.1% de ácido fórmico como disolventes A y B, respectivamente. El gradiente se inició y se mantuvo 5 min a 5%, tras lo cual se elevó gradualmente hasta 70% durante 120 min, y finalmente se mantuvo a 90% durante 5min. Los péptidos eluidos en el ESI se analizaron en experimentos independientes de MS. Se emplearon los siguientes parámetros para realizar el barrido de iones: Modo Full-scan MS (m/z 400-1800) junto con modo Siete Péptidos Mayoritarios Zoom/MS/MS (anchura de aislamiento del ratio m/z de 2), colisión normalizada de energía 35%. El barrido se llevó a cabo mediante el empleo de una lista de exclusión dinámica (de 30 seg, tamaño 500 y ancho de exclusión de m/z de 3). Se utilizaron dos motores de búsqueda para realizar la identificación de las proteínas: Sequest y MACOT. Las búsquedas en Sequest se hicieron mediante el programa BioWorks 3.2 (Thermo Fisher), empleando los siguientes parámetros: base de datos, IPI versión 3.45; tolerancia de masa de péptido, 200ppm; tolerancia de masa de fragmento, 0.5 Da y un máximo de 2 puntos de corte fallidos. Los filtros empleados para dar por validas las identificaciones fueron una probabilidad de péptido de 10-3 y una puntuación de correlación cruzada (Xcorr) de 2.0 para iones carga 2+ y de 2.5 para los de carga 3+. En cuanto a las búsquedas de MASCOT, se realizaron con parámetros similares a las de Sequest, salvo por el empleo de la base de datos SwissProt versión 56.6, además de la de IPI; permitiendo un máximo de 1 puntos de corte fallido, y empleando como punto de corte para dar por validas las

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identificaciones un pvalor de 0.05. Tanto en Sequest como en MASCOT se consideraron las siguientes modificaciones: carbamidometilación de las Cys (fija) y oxidación de las metioninas (variable). En cada búsqueda se llevó a cabo una búsqueda inversa simultánea, de manera que se eliminaron todas las identificaciones que tuvieran una puntuación inferior a la de la primera identificación inversa aparecida.

8.2.2. Detección de marcaje isotópico en espectros de MS/MS de trampa líneal, LTQ

Para analizar el marcaje isotópico de las muestras de secretoma en las que se incluyeron los aminoácidos Lys y Arg marcados, se analizaron los espectros de MS/MS empleando el programa MSQuant. Este programa busca de manera automática los pares de masas de las moléculas de un peptido que incorporan el marcaje (forma pesada) y de las que no lo incorporan (ligera). Según la cinética de incorporación del marcaje de cada proteína observaremos diferente abundancia de una y otra forma, lo cual será representativo de la velocidad de síntesis y secreción al medio de las proteínas identificadas. Cuanto mayor sea la proporción de forma pesada respecto a la ligera, mayor será la velocidad de secreción de la proteína.

8.2.3. Identificación por LTQ-OrbiTrap

Una vez digeridas las muestras de secretoma, de manera similar a las muestras analizadas por el LTQ, los péptidos trípticos resultantes se inyectaron en una nano- columna de fase reversa C-18 (diámetro interno de 100 µm y 12cm de longitud, Mediterranean sea, Teknokroma) en la que se analizaron en un gradiente continuo de acetonitrilo de 0 a 50% de disolución B durante 45 min, 50-90% B en 1 min (B=95% acetonitrilo, 0.5% ácido acético), en un HPLC Ultimate 3000 (LC-Packings). Se empleó un flujo de 300nL/min para eluir los péptidos de la columna al ESI de un LTQ-Orbitrap XL. Se analizó, a lo largo de la carrera cromatográfica, el espectro de resolución

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mejorada mediante transformada de Fourier (resolución=30000) y los espectros de MS/MS de los cinco iones parentales de mayor intensidad. La exclusión dinámica se fijo en 1 minuto. Para la identificación de las proteínas, se lanzaron búsquedas con los espectros de fragmentación en Sequest y MASCOT, empleando el paquete informático Proteome Discoverer 1.0 (Thermo Fisher). Las bases de datos empleadas fueron SwissProt en el caso de MASCOT, y NCBInr para el de Sequest. Los parámetros de búsqueda fueron los siguientes: máximo de 2 puntos de corte fallidos, y errores de 10ppm y 0.8 Da para espectros de MS y MS/MS, respectivamente. Se estableció un valor de 0.05 como punto de corte del valor de la tasa de falsos-positivos (false

discovery rate, FDR) para las identificaciones.