Non-linear model tests.

2.2.4.1 Preparación de células competente Método RbCl (método Kushner) 

Para  la  trasformación  química,  las  células  fueron  preparadas  mediante  el  método    de  RbCl  (Kushner).  Una  colonia  de  una  placa  de  LB  agar  suplementado  con  timina (50μg/ml) y cloranfenicol (20μg/ml) o kanamicina (50μg/ml), dependiendo de la  resistencia a antibióticos de cada cepa fue inoculada en 5 ml de medio líquido y crecida  durante  toda  la  noche  con  agitación.  El  cultivo  fue  diluido  1:100  y  crecido  hasta  alcanzar 60 unidades klett. Las células fueron centrifugadas durante 10 minutos a 5000  rpm a 4 °C. Las células fueron resuspendidas en 10 ml de medio TFB 1 (100 mM RbCl,  50  mM  MnCl2,  30  mM  acetato  potásico,  10  mM  CaCl2,    15%  glicerol,  pH  5.8),  y 

centrifugadas otra vez. El pellet fue resuspendido en 10 ml de TFB2 (10 mM MOPS, 10  mM RbCl, 75 mM CaCl2, 15% glycerol, pH 6.8)  y centrifugado como anteriormente. Las 

células  fueron  incubadas  a  hielo  durante  30  minutos  en  1  ml  de  TFB2.  Las  células  fueron  centrifugadas  y  resuspendidas  en  100  μl  de  TFB2  y  se  mezcló  con  4‐8    μl  del  plásmido  y se incubó en hielo durante 1 hora. El choque térmico fue realizado 42 °C  durante   1 minuto. A continuación se centrífugo el pellet, se resuspendió en 3 ml de  SOC y se incubó a 37 °C durante una hora. Posteriormente se centrífugo, se eliminó el  sobrenadante,  se  resuspendió  en  1ml  de  SOC  y  se  sembraron  100  μl  de  células  en  placa con medio selectivo.  

2.2.4.2 Preparación de células electrocompetentes. 

Las  células  electrocompententes  fueron  preparadas  tal  y  como  describen  (Sharma and Schimke, 1996 Biotechniques) usando un medio libre de sal denominado  YENB (medios). Se  preparó un inoculo que fue crecido toda la noche en medio YENB.  Al  día  siguiente  se  inoculó  10  ml  del  cultivo  crecido  toda  la  noche  en  1  L  de  medio  fresco YENB. El cultivo fue crecido en agitación (250 rpm) y a 37°C durante 4‐5 horas  hasta alcanzar una OD600 de aproximadamente 0.5. Las células fueron recogidas en dos 

botellas  estériles  de  policarbonato  de  500  ml  previamente  enfriadas  a  4ºC  mediante  centrifugación  a  4°C  durante  10  minutos  a  4000g  en  un  rotor  JA‐10.  Se  retiró  el  sobrenadante y el pellet fue lavado dos veces con 100 ml de agua destilada estéril y 

fría,  y  centrifugando  igual  que  antes.  Se  descartó  el  sobrenadante,  el  pellet  fue  resuspendido  en  20  ml  de  glicerol  frío  al  10%  y  centrifugado  igual  que  antes.  Se  descarta el sobrenadante y se resuspenden las células en 2 ml de 10% de glicerol. Las  células  fueron  alicuotadas  en  tubos  de  microcentrífuga  de  1.5  ml  (40  μl/tubo)  y  colocadas en una caja con hielo seco y etanol hasta su congelación. Posteriormente se  guardaron a ‐80ºC hasta su uso.   2.2.4.3 Transformación  Para transformar se descongelan los tubos de microcentrífuga con las alícuotas  de células competentes guardados a ‐80 °C, se añaden entre 3‐5 μl de la reacción de  ligación, se mezclan suavemente con una punta de pipeta y se incuban durante 1 hora  en hielo. Aplicar un golpe de calor de 45 segundos a 37 °C en un baño termostático de  agua. Se añade 1 ml de SOC a las células y se incuba a 37 °C durante 45 minutos para  permitir la expresión de los genes de resistencia a antibióticos.  A continuación 100 μl  de  cultivo  fueron  sembrados  en  una  placa  de  LB  agar  contiendo  el  apropiado  antibiótico e incubado a 37 °C durante toda la noche.  

2.2.4.4 Electroporación 

Las electroporaciones fueron llevadas a cabo en el electroporador Gene Pulser  (Bio‐Rad  Laboratories,Hercules,  CA,  USA)  bajo  las  siguientes  condiciones:  200  Ω,  2,5  μF, 2,5 KV.  Cada transformación fue realizada de la siguiente manera: una alicuota de  40 μl de células electrocompetentes fue descongela y mezclada con volumen de 1‐2.5  μl  (0,05‐0,2μg/μl)  de  plásmido  disuelto  en  agua  o  reacción  de  ligado  previamente  dializado  contra  agua  estéril  durante  30  minutos  a  temperatura    ambiente  usando  filtros  tipo  VS  (0.025  μM  de  tamaño  de  poro;  Millipore, Bedford,  MA)  para evitar  un  arco  eléctrico.  La  mezcla  se  añadió  a  una  cubeta  de  electroporación  (Bio‐Rad  Laboratories,Hercules,  CA,  USA)  estéril  de  2  mm  de  distancia  entre  los  electrodos  de  aluminio  previamente  enfriada  en  hielo.  Se  aplicó  un  pulso  eléctrico  sencillo  de  una  duración de 5‐6 mseg  a la suspensión de células y DNA plasmídico, se añadió  1 ml de  SOC  para  recuperar  las    células  y  se  transfirió  la  mezcla  a    un  tubo  de  ensayo.    Se  incubó  a  37°C  durante  45  minutos  y  luego  se  extendieron  unos    10‐50  μl    de 

suspensión celular a cada placa de Petri con  agar y  medio selectivo utilizando un asa  de  Drigalski  previamente  esterilizado  con  etanol  y  a  la  llama.  Se  incubaron  en  un  incubador a 37 °C durante 20 horas o hasta que aparecieran colonias. 

2.2.5 Mutagénesis   

2.2.5.1 Mutagénesis aleatoria in vitro del plásmido pJRK1. 

El  plásmido  pJRK1  fue  purificado  usando  Qiaprep  spin  minipred  kit  (Qiagen,  Valencia, CA). Tres microgramos del plásmido  pJRK1 fueron incubados en presencia de  400 mM de hidroxilamina (NH2OH), 50 mM de fosfato potásico (pH 6.6), 100 mM EDTA 

en un  volumen final de 100 μl  durante una hora a 65 °C  seguido de una incubación a  37°C  durante  toda  la  noche.    Todo  el  volumen  fue    dializado  contra  agua  estéril  durante  dos  horas  a  temperatura    ambiente  usando  filtros  tipo  VS  (0.025  μM  de  tamaño de poro; Millipore, Bedford, MA). A continuación se realizó precipitación con  etanol  y  lavado  con  etanol  al  70%.  El  DNA  plasmídico  fue  resuspendido  en  20  μl  de  agua destilada. 

2.2.5.2 Aislamiento de mutantes termosensibles. 

Células  SK9714  electrocompetentes  fueron  electrotransformadas  con  80ng  de  plásmido  mutagenizado  e  incubadas  a  30  °C  en  LB  suplementado  con  timina  y    50  μg/ml    de  kanamicina.  Los  cultivos  fueron  diluidos  cada  12  horas  con  medio  fresco  durante  tres  días,  de  forma  que  el  plásmido  residente  de  la  cepa  SK9714  fuera  desplazado por aquellos plásmidos mutagenizados, que retuvieran actividad catalítica,  al menos a 30 °C. A los tres días los cultivos fueron diluidos de tal forma que hubieran  entre  300  y  3000  células/ml,  y  100  μl  fueron  sembrados  en  placas  de  LB  agar  suplementado con 50 μg/ml  de timina y  50 μg/ml  de kanamicina e incubadas a 30 °C  durante  toda  la  noche.  Al  día  siguiente,  se  realizó  una  réplica  en  placa    y  las  placas  replicadas fueron incubadas a 44 °C durante toda la noche.   

Una única colonia termosensible por transformación fue elegida para posterior  análisis  asegurándonos  de  esta  forma  que  los  mutantes  fueron  generados  por  independientes eventos mutagénicos. Los mutantes termosensibles fueron verificados