Las modificaciones epigenéticas, como la metilación del ADN, la modificación de H y el remodelado de la cromatina son eventos regulatorios de importancia en varios procesos biológicos, entre ellos la espermatogénesis. Varios genes en el testículo están regulados a través de estos mecanismos, lo que demuestra la influencia directa de la epigenética en ese proceso. Entonces, se buscó información in silico para investigar si la regulación de la transcripción de Gpat2 podría estar también regulada por alguno de ellos.
Cuando se habla de metilación como mecanismo de regulación de la transcripción de un gen, se hace referencia a la metilación de citosinas (C) que están en los promotores o en las cercanías de primer exón de los genes e las de o i adas Islas CpG [104]. Existen varios programas online que detectan estas regiones en secuencias de ADN, entre ellos la aplicación
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Epigenomics que pertenece a NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/epigenomics) y el sitio
MethPrimer, del Departamento de Urología de UCSF (http://www.urogene.org/cgi-
bin/methprimer/methprimer.cgi). En la figura 1.12 se muestra una captura de pantalla donde
se observan las Islas CpG que se detectaron en Epigenomics. Al igual que muchas otras Islas CpG en otros genes [105, 106], las que se encontraron en el gen de Gpat2 se encuentran en las cercanías del primer exón.
Figura 1.12. Análisis de la presencia de Islas CpG en el gen de Gpat2 de ratón. Se muestra una captura de pantalla del análisis de Gpat2 de ratón en Epigenomics de NCBI. Se detectaron dos posibles Islas CpG alrededor del primer exón (círculo rojo).
Esta información fue el puntapié para estudiar en detalle cuáles son las C susceptibles a ser metiladas y determinar si su estado de metilación influye y/o se correlaciona con el perfil de expresión de Gpat2 durante la maduración testicular. Para el diseño de primers para amplificar la región CpG post tratamiento con bisulfito de sodio, se analizó la región promotora de Gpat2
con el software disponible en el sitio web MethPrimer.Para evitar errores, se diseñaron primers
para aparear por fuera de la isla predicha, que abarquen la mayor parte posible de las C de los pares CGs blanco de las metiltransefrasas. En la figura 1.13 se muestra una captura de pantalla del análisis de la región promotora de ratón desde -1324 hasta el inicio de la traducción. En lugar de detectar dos Islas CpG como Epigenomics, detecta una gran Isla CpG que abarca ambas que va desde la posición -92 a +32. Algunos pares de primers sugeridos fueron adquiridos para amplificar por PCR la zona de interés post tratamiento con bisulfito de sodio.
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La modificación de H, como su acetilación/desacetilación, es otro tipo de regulación epigenética posible. Haciendo uso de la aplicación GEO Profiles de NCBI se encontró el histograma de la figura 1.14 al i g esa las pala as la e Gpat2 histone deacetylase
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/?term=Gpat2+histone+deacetylase). Los niveles de
expresión de Gpat2 se obtuvieron del análisis del transcriptoma de células miocárdicas de ratones KO para el gen de la enzima HDAC2.
Figura 1.13. Análisis de la región circundante al primer exón de
Gpat2 de ratón con el sitio web
MethPrimer para el diseño de
primers para amplificar por PCR la Isla CpG post tratamiento con bisulfito de sodio del ADN genómico. En lugar de detectar dos Islas CpG como Epigenomics, detecta una gran Isla CpG que abarca ambas. Con una flecha se indica el inicio de la transcripción.
Figura 1.13. Diseño de primers post tratamiento con bisulfito de sodio para analizar la metilación de la región circundante al primer exón de Gpat2 de ratón.
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Generalmente, la acetilación de H denota regiones transcripcionalmente activas, mientras que la hipoacetilación de las mismas ocurre en regiones transcripcionalmente inactivas [107]. Este proceso está regulado por las enzimas HATs, quienes activan la transcripción, y las HDACs, quienes silencian la transcripción génica [42]. Por lo tanto, si un organismo carece de HDAC, sus H permanecerían acetiladas y por lo tanto la transcripción estará activa, a menos en lo que respecta a nivel de apertura de la cromatina por acetilación de H. En la figura 1.14 se observa cómo al knockear la expresión de la HDAC2 en ratón se dispara la expresión de Gpat2 en músculo cardíaco, un tejido donde normalmente no se expresa esta enzima. Por lo tanto, se decidió evaluar experimentalmente si tanto la metilación del ADN como la modificación de H afectan la transcripción de Gpat2 en células de ratón.
Figura 1.14. Resultado in silico
que evidencia la regulación epigenética de la expresión de
Gpat2. Captura de pantalla del resultado encontrado en GEO Profiles de NCBI bajo las palabras
la e GPAT2 histone
deacetylase . La e p esió de
Gpat2 aumenta abruptamente en ratones KO para Hdac2 en un tejido en donde no se expresa normalmente, como el músculo cardíaco.
Figura 1.14. Resultado in silico que demuestra la influencia de la acetilación de H en la regulación de la transcripción de Gpat2.
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