Nucleic Acid

2.5.1. Estudio de la expresión y localización de HA.

Estudios previos habían demostrado que en ciertas cepas de virus la expresión de la proteína M2 es importante para la protección de la HA durante su procesamiento y transporte hacia la membrana celular(Ohuchi et al., 1994; Takeuchi and Lamb, 1994). Para confirmar si la menor acumulación de la proteína M2 en células infectadas por el virus mutante a temperatura restrictiva podía estar afectando a la expresión y localización de la HA, se analizó su síntesis y localización tal y como se describe en los apartados 5.2 y 5.3 de Materiales y Métodos. Debido a que la HA es una glicoproteína, fue necesario un tratamiento de deglicosilación que permitiera la correcta identificación de la banda específica en los geles de poliacrilamida. El tratamiento de deglicosilación reveló la aparición de una nueva banda de movilidad intermedia entre la de NP y polimerasa, correspondiente a la HA(Figura 28, paneles +PNGaseF). De esta forma se pudo comparar de una manera fiable la síntesis de HA en células infectadas por ambos virus y a ambas temperaturas. Los resultados indicaron que su expresión en células infectadas por el mutante a temperatura restrictiva no estaba afectada.

En cuanto a su localización en membrana, se comparó el marcaje anti-HA en células previamente permeabilizadas o no permeabilizadas. Al realizar la tinción en células sin tratamiento de permeabilización previo, nos asegurábamos que el marcaje observado era debido a la HA presente en la membrana ya que el anticuerpo no puede penetrar al interior de la célula. Los resultados que se presentan en la Figura 29, mostraron, en todos los casos, una correcta localización de HA en la membrana celular.

32º C 39º C 32º C 39º C wt 11C + P - P 32º C 39º C 32º C 39º C wt 11C + P - P Figura 29. Localización de HA en células infectadas por los virus recombinante control (wt) o mutante 11C. Se infectaron

monocapas de células a una mdi de 10 ufp/célula con los virus control (wt) o mutante a ambas tempera- turas de 32º y 39º C. A 8 hpi (32º C) o 6 hpi (39º C) se fijaron los cultivos con paraformaldehído. La mitad de los cultivos se permea- bilizaron con Triton X100 (+P), mientras que la otra mitad no (-P). Los cultivos se analizaron por IF con el anticuerpo monoclonal H179, específico contra HA de la cepa WSN. Como control se usaron células sin infectar, las cuales no presentaron señal de fluorescencia alguna (datos no mostrados).

Figura 28. Expresión de HA en células infectadas con los virus recombi- nante control (wt) o mu- tante 11C. Se infectaron

monocapas de células MDCK a 10 upf/célula con ambos virus tanto a tem- peratura permisiva como restrictiva. A los tiempos que se indican en la parte superior de cada carril, se realizó un marcaje meta- bólico con 35S Met-Cys. Los extractos celulares se sometieron (+PNGase F) o no (-PNGase F) a un tratamiento de deglicosila- ción con la enzima PNGase F y el producto se analizó por electroforesis en geles de poliacrilamida y autoradiografía. La po- sición de las principales proteínas virales se indica en el lado derecho de las imágenes.

2.5.2. Estudio de la expresión y localización de NA.

Para analizar la expresión de la otra glicoproteína de membrana, NA, se realizaron experimentos de inmunoprecipitación usando un anticuerpo monoclonal específico frente a NA o un anticuerpo control, tal y como se describe en el apartado 5.5 de Materiales y Métodos. Para ello, se infectaron células MDCK a alta mdi con los virus mutante o control, tanto a 32º como a 39º C. Tras un marcaje metabólico continuo de 8 o 10 horas (según la temperatura de incubación) se realizaron las inmunoprecipitaciones correspondientes. Los resultados se presentan en la Figura 30. Se observó una ligera disminución en la expresión de NA en las células infectadas por el virus mutante a temperatura permisiva. Dicha diferencia se vio fuertemente aumentada en las células infectadas con el virus mutante a temperatura restrictiva, hasta el punto de que no fue posible detectar la presencia de NA en el inmunoprecipitado.

Figura 30. Expresión de NA en células infectadas con los virus recombinante control (wt) o mutante 11C.

Se infectaron monocapas de células MDCK con los virus recombinante control (wt) o mutante a una mdi de 10 ufp/célula. Se incubaron los cultivos tanto a temperatura permisiva como restrictiva. Durante el tiempo de infec- ción se realizó un marcaje metabólico continuo con 35S Met-Cys. A las 10 hpi (32º C) o 8 hpi (39º C) se prepa- raron extractos celulares y se inmunoprecipitaron con el anticuerpo monoclonal anti- NA M234/1/G10 (-NA) y un anticuerpo control (Ctr). La proteína inmunoprecipi- tada se analizó por electro- foresis en geles de poliacri- lamida y autoradiografía. La posición de las bandas de NA se indica en la parte izquier- da de las imágenes: mNA monómero de NA; dNA dí- mero de NA y tNA tetrámero de NA. m NA d NA t NA m NA d NA t NA

Ctr. -NA Ctr. -NA Ctr. -NA

wt 11C Mock m NA d NA t NA m NA d NA t NA

Ctr. -NA Ctr. -NA Ctr. -NA

wt 3 2 º C 3 9 º C 11C Mock m NA d NA t NA m NA d NA t NA

Ctr. -NA Ctr. -NA Ctr. -NA

wt 11C Mock m NA d NA t NA m NA d NA t NA

Ctr. -NA Ctr. -NA Ctr. -NA

wt 3 2 º C 3 9 º C 11C Mock

Este resultado se confirmó mediante estudios de inmunofluorescencia tal y como se muestra en laFigura 31, donde se pudo apreciar un marcaje de NA muy tenue en las células infectadas por el mutante a temperatura restrictiva comparándolo con las infectadas por el virus wt. Como control de que todas las células realmente habían sido infectadas se realizó un doble marcaje con un anticuerpo frente a NP. Tal y como se muestra en los paneles anti-NP, el nivel y evolución de la infección fue muy similar en todos los casos.