Numerical simulation of XRD structure factors for disordered stackings

1.1. Crioconservación de ejes embrionarios de castaño

En los ejes embrionarios de castaño se aplicó la técnica de desecación parcial para lograr la crioconservación de este material.

Inicialmente se determinó el contenido hídrico de los ejes embrionarios en base a su peso fresco, después de ser sometidos a los distintos períodos de desecación en la cámara de flujo laminar, antes de comenzar los ensayos de desecación. El contenido hídrico de los ejes recién aislados fue de 65,7 %, observándose una disminución progresiva, hasta alcanzar 18 % después de 6 horas de desecación (Tabla 4).

En el material que no fue sometido a crioconservación, una vez realizada la desecación de los ejes y después de 2 semanas de cultivo, se observó el crecimiento del hipocótilo alcanzando la raíz una longitud de 20 a 25 mm. Los epicótilos comenzaron su crecimiento después de tres semanas en cultivo, y a las cuatro semanas empezó el desarrollo de las hojas. En este material no crioconservado hubo un incremento en los porcentajes de supervivencia, desde 83% al 100% al incrementar de 2 a 6 horas el período de desecación (Tabla 4). La mayoría de estos ejes fueron capaces de germinar y producir plántulas, y de hecho el 100% de los ejes desecados hasta un contenido hídrico comprendido entre 29 a 35% desarrollaron una plántula (Foto 1).

Por otra parte, los ejes embrionarios crioconservados (Tabla 4) germinaron desarrollando brote y raíz o solamente raíz, pero no se observó formación de tejido de callo. Los porcentajes de supervivencia aumentaron con la disminución de los contenidos de humedad, desde 0% para los ejes no deshidratados hasta un 100% en embriones con contenidos de humedad de aproximadamente el 20%. Los porcentajes de regeneración de plántula aumentaron desde 0% para ejes no desecados hasta 63% en aquellos con contenidos hídricos del 20%. Sin embargo, los contenidos de humedad inferiores a 20%, produjeron una disminución en la recuperación de plántulas (10,3%), aunque el 79,3 % desarrollaron solamente radícula (Foto 1).

Las longitudes de brote y radícula de las plántulas recuperadas mostraron gran variabilidad, no se observaron diferencias significativas entre los ejes crioconservados (NL+) y sus controles sin aplicación de nitrógeno líquido.

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Tabla 4: Contenidos de humedad (en base a su peso fresco) de los ejes embrionarios de Castanea sativa sometidos a distintos períodos de

desecación. Tasa de supervivencia y de recuperación de los ejes crioconservados (NL+) y sus controles (NL-), evaluados a las 8 semanas de cultivo en medio de recuperación.

Desecación (horas) 0 1 2 3 4 5 6 Contenido de humedad (%) 65,7±0,4 51,1±1,1 35,2±1,6 28,8±1,5 23,7±1,1 19,7±0,7 18,1±0,4 NL- 83,3a 88,9a 100b 100b 97,1b 100b 100b Supervivencia (%) NL+ 0,0a 10,3b 20,0b 67,9c 92,8d 100e 89,6d

NL- 11,9b 0,0a 0,0a 0,0a 25,7c 24,1c 43,3d

Sólo crecimiento de radícula(%)

NL+ 0,0a 10,3b 4,0b 28,3c 32,1c 36,7c 79,3d NL- 71,4a 88,9b 100c 100c 71,4a 75,9ª 56,7d Regeneración de plántula (%) NL+ 0,0a 0,0a 16,0b 39,6c 60,7d 63,3d 10,3b NL- 51,5±2,5 39,2±2,2 59,9±4,7 60,8±3,8 54,1±1,5 39,9±2,8 53,7±9,1 Longitud de radícula (mm) NL+ - - 20,5±4,4 43,5±5,0 45,2±3,6 50,3±2,9 41,3±16,0 NL- 24,5±1,4 20,4±1,8 30,2±0,8 28,8±2,9 29,6±0,9 23,5±3,7 32,0±4,2 Longitud de brote(mm) NL+ - - 15,3±6,0 26,7±0,7 25,7±1,3 21,8±2,6 38,3±11,4 Los valores corresponden a las medias ± E.S.

En cada fila, las medias con la misma letra no presentan diferencias significativas a un nivel del 5 % (p≤0,05) de acuerdo con el test de independencia (Chi- cuadrado).

.

A

B

C

D

FOTO 1: Desarrollo de pl ántulas a partir de ejes embrionarios de Castanea sativa desecados a contenidos hídricos de : A) 51%; B) 35%; C) 29% y D) 24% y posteriormente

1. 2. Crioconservación de ápices caulinares de castaño mediante la técnica de de vitrificación

1.2.1. Efecto del período de aplicación de la solución de PVS2 en clones juveniles

Una vez aplicada la metodología de vitrificación e inmersión en nitrógeno líquido (según Material y Métodos), los ápices caulinares de castaño tomaron una apariencia negruzca a las 24 horas de ser descongelados, pero tras 10 días de cultivo en un medio de recuperación, los ápices que sobrevivieron recobraron su coloración y retomaron el crecimiento. El primer signo de crecimiento organizado se produjo a las 4 semanas después de la crioconservación, al aparecer las primeras hojas, este desarrollo continuó con la regeneración de brotes sin producir tejido de callo. Los ápices que sobrevivieron y que no desarrollaron brotes, produjeron callos, que no dieron origen a brotes. Por esta razón la tasa de regeneración de brotes fue menor que la tasa de supervivencia.

En el clon 818 la aplicación de PVS2 en los ápices tratados y no congelados resultó tóxica a partir de 120 minutos de tratamiento. El porcentaje de supervivencia y de regeneración de brotes disminuyó significativamente al aumentar el tiempo de exposición a la solución de PVS2 (p<0,05 y p<0,01 respectivamente), sin embargo este efecto no se observó en el caso del clon 12 (Tabla 5). En ninguno de los clones se observaron diferencias significativas entre los controles sin tratamiento alguno y los controles tratados solamente con la solución de “loading” (SL) (sin PVS2).

Ninguno de los ápices caulinares crioconservados de ambos clones fue capaz de sobrevivir al tratamiento con nitrógeno líquido sin la solución de “loading”, y en el clon 12 se observó además la necesidad de la aplicación de la solución de PVS2. El valor máximo de supervivencia después de la descongelación de material (82%) se alcanzó con 140 minutos de exposición a la solución de PVS2 en el clon 818, y con 80 minutos en el caso del clon 12; sin embargo no se observaron diferencias significativas en los porcentajes de supervivencia entre los distintos períodos de inmersión en PVS2 para ambos clones (Tabla 5).

El mejor porcentaje de regeneración de brotes (25%-27%) se alcanzó con 120 minutos de exposición a la solución de PVS2, sin embargo no hubo diferencias significativas con respecto a tratamientos con un tiempo de exposición mayor (clon 818) ni con exposiciones inferiores (ambos clones) (Tabla 5). Los ápices caulinares tratados sólo con la solución de “loading” antes de la crioconservación no fueron capaces de regenerar brotes. Sin embargo la omisión de este pretratamiento antes de la aplicación de PVS2 durante 120 minutos dio lugar a porcentajes significativamente inferiores (valores no mostrados). Considerando los

resultados obtenidos en este experimento, se decidió utilizar, la solución de “loading” durante 20 minutos, seguido de la aplicación de PVS2 durante 120 minutos a una temperatura de 0ºC, en todos los ensayos posteriores (Foto 2).

Foto 2: Brotes desarrollados a partir de ápices crioconservados del clon 818, después de ocho