THE ORIGINS OF CAPITALIST DEVELOPMENT AND THE MODERN STATE

Al comienzo de esta tesis doctoral se había determinado la secuencia nucleotídica del gRNA mayoritario de siete aislados con orígenes geográficos y características patogénicas diferentes: T36 (Pappu et al., 1994; Karasev et al., 1995) y T30 (Albiach-Marti et al., 2000a) de Florida, VT de Israel (Mawassi et al., 1996), T385 (Vives et al., 1999) de España, SY568 (Yang et al., 1999; Vives et al., 2005) de California, NUagA de Japón (Suastika et al., 2001) y Qaha de Egipto (GenBank accession number AY340974), más secuencias parciales de otros aislados. Los aislados T385 y T30 son esencialmente asintomáticos, T36 causa los síndromes DL y SY, VT induce DL, SY y de forma ocasional SP suave en pomelo, SY568 y NUagA causan síntomas intensos en lima Mexicana y otros huéspedes, DL y SY, pero mientras se conoce que SY568 induce SP pronunciado en naranjo dulce (Citrus sinensis (L.) Osb) y pomelo, no se ha descrito el efecto de NUagA en estos huéspedes (Suastika et al., 2001). Los síntomas que induce el aislado Qaha tampoco han sido descritos. Todos ellos presentan la misma organización genómica, sin embargo, los aislados que difieren biológicamente tienen también diferencias de secuencia variables a lo largo

INTRODUCCIÓN GENERAL

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de su gRNA (Albiach-Marti et al., 2000a; Mawassi et al., 1996; Vives et al.,

1999, 2005).

El análisis filogenético de las siete secuencias completas mostraron tres grupos principales que incluían: i) los aislados virulentos inductores de SP en naranjo dulce o pomelo, SY568R, NUagA y VT, ii) los aislados asintomáticos T30 y T385, y iii) los aislados T36 y Qaha. Las identidades nucleotídicas dentro de cada grupo fueron superiores al 97.5%, mientras que la identidad más baja se daba entre los aislados VT y Qaha (75.6%).

Figura 13. Árbol filogenético consenso obtenido con el método de Neighbor-Joining

y 1000 réplicas de bootstrap a partir de las siete secuencias completas de CTV

disponibles en la base de datos al comenzar este trabajo de tesis. (*) Nodo

detectado en el 90-100% de las réplicas.

Las secuencias de los aislados T36 y Qaha son prácticamente idénticas como también lo son T30 y T385 a pesar de que han estado separados al menos 24 años en huéspedes y ambientes distintos. Fragmentos de secuencia idéntica a la de estos aislados han sido también detectados en otros aislados de zonas geográficas distintas como los aislados B252 de Taiwán, B272 de Colombia y B354 de California (Albiach- Marti et al., 2000a), lo que sugiere que podría tratarse de un genotipo bien adaptado que habría sido seleccionado en el proceso evolutivo de CTV. En

SY568 R SY568 R NUagA NUagA VT VT T385 T385 T30 T30 T36 T36 Qaha Qaha 0,02 0,02 * * * *

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31 cambio, SY568 parece ser el resultado de un fenómeno de recombinación entre un antepasado de SY568 y otro tipo T385/T30 (Vives et al., 1999, 2005).

La variación genética está irregularmente distribuida a lo largo del gRNA de CTV, siendo la región más conservada el extremo 3´ UTR, con una identidad entre aislados superior al 95% y la más variable el extremo 5´ UTR, con valores de identidad en ocasiones inferiores al 50%. Sin embargo, todas las secuencias del 5’ UTR obtenidas pudieron ser clasificadas en tres grupos (I, II y III), con una identidad de secuencia intra-grupo superior al 88% y con identidades inter-grupo del 55-57% entre los grupos I y II, 62-64% entre los grupos II y III, y 44-45% entre los grupos I y III. A pesar de esta variabilidad, la estructura secundaria de mínima energía predicha para los tres tipos de secuencia es muy similar y consiste en dos horquillas separadas por una pequeña región espaciadora, en las que los cambios se acumulan en los bucles o mediante mutaciones compensatorias en los tallos de doble cadena (López et al., 1998) (Ver Figura 7). La conservación de esta estructura secundaria sugiere algún papel importante de la misma en el ciclo biológico de CTV, como se ha puesto de manifiesto experimentalmente (Gowda et al., 2003b). Las secuencias 5’ UTR más frecuentes son las de tipo III, que han sido detectadas en casi todos los aislados de CTV analizados, pero mientras que los aislados poco agresivos generalmente contienen sólo este tipo de secuencia, los más virulentos contienen además secuencias de los grupos I, II, o ambos (López et al., 1998; Ayllón et al., 2001). Construcciones quiméricas realizadas sobre el minireplicón ∆cla de T36, en las que se intercambió las regiones 5´ UTR o 3’ UTR por sus homólogas de otros aislados, mostraron una reducción significativa en su nivel de replicación (Satyanarayana et al., 1999).

También se ha observado una distribución desigual de la variación genética entre regiones codificantes e incluso dentro de un mismo gen que probablemente reflejan diferentes presiones de selección a lo largo del gRNA. Por ejemplo, la diversidad genética de un grupo de aislados de California y España fue de 0.038 para el gen de la CP, pero de 0.137 para una región de la ORF 1a (Rubio et al., 2001). Comparaciones de secuencia

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entre aislados de CTV con orígenes geográficos y características patogénicas diferentes mostraron: i) un alto grado de conservación entre genomas de CTV separados en el tiempo y espacio, con un repertorio limitado de genotipos (Albiach-Martí et al., 2000a; Ruiz-Ruiz et al., 2006; Vives et al., 1999) y ii) una estructura poblacional variable entre aislados, con algunos de ellos compuestos por una variante de secuencia mayoritaria y otras variantes estrechamente relacionadas, y otros que presentan una estructura compleja con variantes de secuencia altamente divergentes (Ayllón et al., 2006; Vives et al., 2005).

Los factores que influyen en la variabilidad y estructura de las poblaciones de CTV en campo incluyen la mutación, eventos de recombinación entre variantes de secuencia divergentes, selección, deriva genética y flujo génico debido a las repetidas inoculaciones de los árboles de campo y movimiento de yemas infectadas entre regiones.

La mutación es el proceso por el cual nucleótidos que no estaban presentes en la secuencia molde son incorporados en la cadena hija durante la replicación. Los virus como CTV con un genoma de RNA pueden evolucionar rápidamente debido a que las RNA polimerasas dependientes de RNA (RdRps) presentan una alta tasa de error a consecuencia de la ausencia de las funciones correctoras y reparadoras (Domingo y Holland, 1997). La variación de CTV se evaluó a partir de un aislado de CTV clonal obtenido a partir del único clon infeccioso de cDNA del aislado T36 (Satyanarayana et al., 1999, 2001) que se propagó consecutivamente en plantas de cuatro especies de cítricos diferentes. Los análisis de las poblaciones resultantes mostraron una estabilidad genética elevada en algunos huéspedes, como se ha observado en otros virus de plantas (García-Arenal et al., 2001), pero una rápida diversificación en otros huéspedes, sugiriendo que este segundo tipo de huéspedes podría haber contribuido a la diversificación de CTV una vez que el virus se movió de sus áreas de origen y tuvo contacto con la nuevas especies huésped (Moya et al., datos no publicados).

La recombinación es el proceso mediante el cual se intercambian segmentos de información genética entre las cadenas nucleotídicas de

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33 diferentes variantes genéticas durante el proceso de replicación. La recombinación homóloga y no-homóloga podría ser una forma rápida de evolución de CTV. La recombinación no homóloga ha sido ampliamente documentada en la generación de múltiples dRNAs (Ayllón et al., 1999a; Guerri et al., 1991; Mawassi et al., 1995a, b; Yang et al., 1997). La recombinación homóloga se observó por primera vez comparando las secuencias del gRNA de los aislados T36 o SY568 con la de otros aislados (Mawassi et al., 1996; Vives et al., 1999, 2005) y después se ha confirmado mediante comparaciones de secuencia adicionales.

Los valores de diversidad nucleotídica estimados entre aislados de CTV en algunas regiones codificantes fueron superiores a 0.13, si bien la mayoría de las sustituciones eran transiciones que generalmente afectaban a la tercera posición del codón. De hecho la relación entre sustituciones sinónimas y no sinónimas (dN/dS) estimada para todas las regiones del gRNA analizadas estuvo por debajo de 1 (Rubio et al., 2001; Sambade et al., datos no publicados) y dentro del intervalo de valores calculados para otros virus de plantas (García-Arenal et al., 2001). Además, se han observado otras diferencias de secuencia compatibles con la deriva genética, probablemente asociadas con un tamaño eficaz reducido de las poblaciones virales causado por los cuellos de botella que suponen la transmisión por pulgones o el cambio de huésped (Albiach-Martí et al., 2000b; Ayllón et al., 2006; Sentandreu et al., 2006). Estos cambios a veces van acompañados de diferentes comportamientos patogénicos de los aislados (Albiach-Martí et al., 2000b; Brlansky et al., 2003; Hermoso de Mendoza et al., 1988a).

Finalmente, las poblaciones de CTV también se ven afectadas por la dispersión natural y cultural del virus. Los cítricos pueden vivir largos períodos de tiempo en el campo y esto permite que a lo largo de su vida puedan sufrir repetidas inoculaciones por pulgones portadores de variantes de secuencia divergentes de CTV, lo que puede dar lugar a poblaciones virales complejas incrementándose la diversidad genética dentro del aislado (Ayllón et al., 2006; Kong et al., 2000; Rubio et al., 2001).

La distribución desigual de variantes de secuencia dentro de las plantas infectadas y/o la selección al azar de algunas de ellas durante la

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adquisición o transmisión por pulgones pueden ser factores adicionales que contribuyen a cambios en la población de CTV en campo (d’Urso et al., 2000, 2003; Sambade et al., 2007). La presencia de variantes de secuencia divergentes en un aislado de CTV también incrementa la posibilidad de variación genética por recombinación (Vives et al., 2005). Por otro lado, el movimiento de yemas infectadas con CTV, tiende a reducir la diversidad genética entre regiones, creando una única población de CTV, como se ha observado para las poblaciones de CTV de California y España (Rubio et al., 2001).

En resumen, aunque CTV parece genéticamente estable en algunos huéspedes, el movimiento incontrolado de germoplasma y las interacciones con diferentes combinaciones de variedad/patrón bajo diferentes condiciones medioambientales dirigidas por el hombre podrían haber generado variabilidad genética, modulada después por otros factores como la recombinación, selección, deriva genética o flujo génico entre regiones.